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无菌检查法-2015版中国药典


录入时间:2014-9-15 14:35:19 来源国家药典委员会

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品生物制品医?#30772;?#20855;原料辅料及其他品种是否无菌的一种方法若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染
    无菌检查应在环境洁?#27426;B 级背景下的?#26893;A 级洁?#27426;?#30340;单向流空气区域内或隔离系统中进行其全过程应?#32454;?#36981;守无菌操作防止微生物污染防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出单向流空气区工作台面及环境应定期按医药工业洁净室区悬浮粒子浮游菌和沉降菌的测试方法的?#20013;?#22269;家标准进行洁?#27426;?#30830;认隔离系统应定期按相关的要求进行验证其内部环境的洁?#27426;?#39035;符合无菌检查的要求日常检验还需对试验环境进行监控
    无菌检查人员必须具备微生物专业知识并经过无菌技术的培训
    培养基
    硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养也可用于需气菌培养胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备亦可使用按?#20040;?#26041;生产的符合规定的脱水培养基配制后应采用验证?#32454;?#30340;灭菌程序灭菌制备好的培养基应保存在225桢避光的环?#24120;?#33509;保存于非密闭容器中一般在3周内使用若保存于密闭容器中一般可在一年内使用

1. 硫乙醇酸盐流体培养基
酪胨 (胰酶水解) 15.0g     酵母浸出粉 5.0g
葡萄糖 5.0g               氯化钠 2.5g
L-胱氨酸 0.5g             新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0ml
硫乙醇酸钠 0.5g           琼脂 0.75g
(或硫乙醇酸) 0.3 ml)   纯化水 1000ml

除葡萄糖和刃天青溶?#21644;?#21462;上述成分混合微温溶解调节pH 为弱碱性煮沸滤清加入葡萄糖和刃天青溶?#28023;?#25671;匀调节pH 值使灭菌后为7.10.2分装至?#23460;?#30340;容器中其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层粉红色不超过培养基深度的1/2灭菌在供试?#26041;?#31181;前培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5否则须经100水浴加热至粉红色消失不超过20 ?#31181;ѩ?#36805;速冷却只限加热一次并防止被污染除另有规定外硫乙醇酸盐流体培养基置3035培养
    2. 胰酪大豆胨液体培养基
胰酪胨 17.0g                            氯化钠 5.0g
大豆木?#31995;?#30333;酶消化物 3.0g               磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖一水合/无水 2.5g 2.3g     纯化水 1000mL
除葡萄糖外取上述成分混合微温溶解?#26031;?#35843;节pH 值使灭菌后在25的pH 值为7.30.2加入葡萄糖分装灭菌胰酪大豆胨液体培养基置2025培养
    3. 选择性培养基
    按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法在培养基灭菌或使用前加入?#23460;?#30340;中?#22270;?#28781;活剂或表面活性剂其用量同方法适用性试验
    4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查
胨 10.0g              氯化钠 5.0g
葡萄糖 5.0g           水 1000 ml
牛肉浸出粉 3.0g
    除葡萄糖外取上述成分混合微温溶解调节 pH 为弱碱性煮沸加入葡萄糖溶解后摇匀滤清调节 pH 值使灭菌后在25的pH 值为7.20.2分装灭菌
    5. 胰酪大豆胨琼脂培养基
胰酪胨 15.0g                 氯化钠 5.0g
大豆木?#31995;?#30333;酶水解物 5.0g    琼脂 15.0g
纯化水 1000ml
    除琼脂外取上述成分混合微温溶解调节pH 值使灭菌后在25的pH 值为7.30.2加入琼脂加热溶化后摇匀分装灭菌
    6.沙氏葡萄糖液体培养基
动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g
葡萄糖 20.0g   纯化水 1000mL
    除葡萄糖外取上述成分混合微温溶解调节pH 值使灭菌后在25的pH 值为5.60.2加入葡萄糖摇匀分装灭菌
    7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基
动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g
葡萄糖 40.0g 纯化水 1000mL
琼脂 15.0g
    除葡萄糖琼脂外取上述成分混合微温溶解调节pH值使灭菌后在25的pH值为5.60.2加入琼脂,加热溶化后, 再加入葡萄糖摇匀分装灭菌
    培养基的适用性检查
    无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行
无菌性检查 每批培养基随机取不少于5 支瓶?#37238;?#22521;养基规定的温度培养14 天应无菌生长
    灵敏度检查
    菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代?#38382;?#19981;得超过5 代从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代并采用?#23460;?#30340;菌种保存技术进行保存?#21592;?#35777;试验菌株的生物学特性
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26 003
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisCMCCB63 501
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B) 64 941
白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98 001
黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F) 98 003
    菌液制备 接种金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中3035培养1824 小时接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上2025培养2448 小时上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100CFU菌落形成单位的菌悬液接种黑曲霉的新鲜培养 物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上2025培养57 天加入35ml 含0.05v/v聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶?#28023;?#23558;孢子洗脱然后采用?#23460;?#30340;方法吸出孢?#26377;?#28082;至无菌试管内用含0.05v/v聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数小于100CFU 的孢?#26377;?#28082;
菌悬液在室温下放置应在2 小时内使用若保存在28可在24 小时内使用黑曲霉孢?#26377;?#28082;可保存在28棬在验证过的贮存期内使用
    培养基接种  取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基7 支分别接?#20013;?#20110;100CFU 的金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌生孢梭菌各2 支另1 支不接种作为空白对照培养3 天取每管装量为9ml 的胰酪大豆胨液体培养基7 支,分别接?#20013;?#20110;100CFU 的枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉各2 支另1 支不接种作为空白对照培养5 天逐日观察结果
    结果判定 空白对?#23637;?#24212;无菌生长若加菌的培养基管均生长良好判该培养基的灵敏度检查符合规定
    稀释液冲洗液及其制备方法
    稀释液冲洗液配制后应采用验证?#32454;?#30340;灭菌程序灭菌
    1.0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g加水1000ml微温溶解滤清调节pH 值至7.10.2分装灭菌
    2pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.56g磷酸氢二钠7.23g氯化钠4.30g蛋白胨1.0g加水1000ml微温溶解滤清分装灭菌
    3. 根据供试品的特性可选用其他经验证过的?#23460;?#30340;溶液作为稀释液冲洗液(如0.9%无菌氯化钠溶液)
如需要可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中?#22270;取?/span>
    方法适用性试验
    当进行产品无菌检查法时应进行方法适用性试验以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时应重新进行方法适用性试验
    方法适用性试验按供试品的无菌检查的规定及下列要求进行操作对每一试验菌应逐一进行方法确认
    菌种及菌液制备 除大肠埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 4 4102外金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉同培养基灵敏度检查大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌
    薄膜过滤法 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤冲洗在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU 的试验菌过滤加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至?#36865;?#20869;另取一装?#22411;?#20307;积培养基的容器加入等量试验菌作为对照?#38665;?#23450;温度培养35 天各试验菌同法操作
    直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6 管分别接入小于100CFU 的金黄色葡萄球菌大肠埃希菌生孢梭菌各2 管取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6 管分别接入小于100CFU 的枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉各2 管其中1 管接入每支培养基规定的供试?#26041;?#31181;量另1 管作为对照?#38665;?#23450;的温度培养35 天
    结果判断 与对?#23637;?#27604;?#24076;?#22914;含供试品各容器中的试验菌均生长良好则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查 如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱缓慢或不生长则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用应采用增加冲洗量增加培养基的用量使用中?#22270;?#25110;灭活剂更换滤膜品种等方法消除供试品的抑菌作用并重新进行方法适用性试验
    方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行
    供试品的无菌检查
    无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法只要供试品性质允许应采用薄膜过滤法供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同
    无菌试验过程中若需使用表面活性剂灭活剂中?#22270;?#31561;试剂应证明其?#34892;?#24615;?#21494;?#24494;生物无毒性
    检验数量 检验数量是指一?#38382;?#39564;所用供试品最小包装容器的数量除另有规定外出厂产品按表1 规定上市产品监督检验按表2 规定表1表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量
    检验量 是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量g 或ml除另有规定外,供试品检验量按表3 规定若每支瓶供试品的装量按规定足够接种两种培养基则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基采用薄膜过滤法时只要供试品特性允许应将所有容器内的全部内容物过滤
    阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品以金黄色葡萄球菌为对照菌抗革?#23478;?#24615;菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌抗厌氧菌的供试品以生孢梭菌为对照菌抗真菌的供试品以白色念珠菌为对照菌阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验加菌量小于100CFU供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量阳性对?#23637;?#22521;养4872 小时应生长良好
    阴性对照 供试品无菌检查时应取相应溶剂和稀释液冲洗?#21644;?#27861;操作作为阴性对照阴性对照不得有菌生长
    供试品处理及接种培养基
    操作时用?#23460;?#30340;消毒液对供试品容器表面进行彻?#32043;?#27602;如果供试品容器内有?#27426;?#30340;真空度可用?#23460;?#30340;无菌器材如带有除菌过滤器的针头向容器内导入无菌空气再按无菌操作启开容器取出内容物除另有规定外按下列方法进行供试品处理及接种培养基
    1.薄膜过滤法
    薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45m?#26412;对?#20026;50mm根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜滤器及滤膜使用前应采用?#23460;?#30340;方法灭菌使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性
    水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜油类供试品其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥为发挥滤膜的最大过滤效率应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面供试液经薄膜过滤后若需要用冲洗液冲洗滤膜?#31354;?#28388;膜每次冲洗量一般为100ml且总冲洗量不得超过1000ml?#21592;?#20813;滤膜上的微生物受损伤
    水溶液供试品 取规定量直接过滤或混合至含不少于100ml ?#23460;?#31232;释液的无菌容器中混匀立即过滤如供试品具有抑菌作用须用冲洗液冲洗滤膜冲洗?#38382;?#19968;般不少于三次所用的冲洗量冲洗方法同方法适用性试验除生物制品外一般样品冲洗后1 份滤器加入100ml 硫乙醇酸盐流体培养基1 份滤器加入100ml 胰酪大豆胨液体培养基生物制品样品冲洗后 2 份滤器加入100ml 硫乙醇酸盐流体培养基1 份滤器加入100ml 胰酪大豆胨液体培养基
    水溶性固体供试品 取规定量加?#23460;?#30340;稀释液溶解或按标签说明复溶然后照水溶液供试品项下的方法操作
    非水溶性供试品 取规定量直接过滤或混合溶于适量含聚山梨酯80或其他?#23460;?#20083;化剂的稀释液中充分混合立即过滤用含0.11%聚山梨酯80 的冲洗液冲洗滤膜至少3 次加入含或不含聚山梨酯80 的培养基接种培养基照水溶液供试品项下的方法操作
    可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性?#22270;?#20379;试品 取规定量混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中剧烈振摇使供试品充分溶解如果需要可?#23454;?#21152;热但温度不得超过44棬趁热迅速过滤对?#21248;?#26080;法过滤的供试品于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加入不少于100ml 的稀释?#28023;?#20805;分振摇萃取静置取下层水相作为供试液过滤过滤后滤膜冲洗及接种培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作
    无菌气喷雾剂供试品 取规定量将各容器置20以下的冰室冷冻约1 小时以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔释放抛射剂后再无菌开启容器并将供试液转移至无菌容器中然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作
    装有药物的注射器供试品 取规定量将注射器中的内容物若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解直接过滤或混合至含?#23460;?#31232;释液的无菌容器中然后按水溶液或非水溶性供试品项下方法操作同时应采用?#23460;?#30340;方法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查
    具有导管的医?#30772;?#20855;(输血输液袋等)供试品 取规定量每个最小包装用50100ml 冲洗液分别冲洗内壁收集冲洗液于无菌容器中然后照水溶液供试品项下方法操作同时应采用直接接种法进行包装中所配带的针头的无菌检查
    2. 直接接种法
    直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中除生物制品外一般样品无菌检查时两种培养基接种的支/瓶数相等生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为21除另有规定外每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不?#20040;?#20110;培养基体积的10%同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml供试品检查时培养基的用量和高度同方法适用性试验
    混悬液?#30830;?#28548;清水溶液供试品 取规定量等量接种至各管培养基中
固体供试品 取规定量直接等量接种至各管培养基中或加入?#23460;?#30340;溶剂溶解或按标签说明复溶后取规定量等量接种至各管培养基中
    非水溶性供试品 取规定量混合加入适量的聚山梨酯80 或其它?#23460;?#30340;乳化剂及稀?#22270;?#20351;其乳化等量接种至各管培养基中或直接等量接种至含聚山梨酯80 或其它?#23460;?#20083;化剂的各管培养基中
敷料供试品 取规定数量以无菌操作拆开每个包装于不同部位剪取约100mg 或1cm3cm 的供试品等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中
    肠线缝合线等供试品 肠线缝合线及其它一次性使用的医用材料按规定量取最小包装无菌拆开包装等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中
    灭菌医用器具供试品 取规定量必要时应将其拆散或切成小碎段等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中
    放射性药品 取供试品1 瓶(支)等量接种于装量为7.5ml 的硫乙醇酸流液体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中每管接种量为0.2ml
    培养及观察
    将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成?#38477;确|?#19968;份置3035培养一份置2025培养培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长如在加入供试品后或在培养过程中培养基出现?#33009;?#22521;养14 天后不能从外观上判断有无微生物生长可取该培养液适量转种至同?#20013;?#40092;培养基中培养3 天观察接种的同?#20013;?#40092;培养基是否再出现?#33009;?#25110;取培养?#21644;?#29255;染色镜检判断是否有菌
    结果判断
阳性对?#23637;?#24212;生长良好阴性对?#23637;?#19981;得有菌生长否则试验无效若供试品管均澄清或虽显?#33009;?#20294;经?#20998;?#26080;菌生长判供试品符合规定若供试品管中任何一管显?#33009;?#24182;?#20998;?#26377;菌生长判供试品不符合规定除非能充?#31181;?#26126;试验结果无效即生长的微生物非供试品所含当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效
1无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求
2回顾无菌试验过程发现有可能引起微生物污染的因素
3供试品管中生长的微生物经鉴定后?#20998;?#26159;因无菌试验中所使用的物品和或无菌操作技术不当引起的
    试验若经确认无效应重试重试时重新取同量供试品依法检查若无菌生长判供试品符合规定若有菌生长判供试品不符合规定

 
表1 批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量

批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量

    注若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基那么表中的最少检验数量加倍

 

表2. 上市抽验样品的最少检验数量

上市抽验样品的最少检验数量


    注1.若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基那么表中的最少检验数量加倍
        2.抗生素粉针剂5 克及抗生素原料药5 克的最少检验数量为6 瓶或支?#30333;?#22266;体原料的最少检验数量为4 个包装

表3. 供试品的最少检验量

供试品的最少检验量

    注 如果医用器械体积过大培养基用量可在2000ml 以上将其完全浸没

 

    说明
    1.无菌检查法收载于中国药典一二三部附录中一部和二部内容一致
    2.本稿以2010 年版二部的无菌检查法为基础进行中的内容进行一二及三部内容的整合并进行了修订
    3..整?#32454;?#20445;留了生物制品无菌检查法的特点如检验数量硫乙醇酸盐培养基接种份数和培养温度?#21462;?/span>
    4..修订稿中检验环境修订为B 级背景下的A 级?#34180;?/span>
    5.改良马丁培养基修订为胰酪大豆胨液体培养基?#34180;?/span>
    6.方法验证试验修订为方法适用性试验
    7.由于培养基的改变培养基的灵敏度和方法适用性试验也进行了修订
    8.修订了表1表2表3 的内容

 

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