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非无菌产品微生物限度检查微生物计数法-2015中国药典


录入时间:2014-9-16 10:36:19 来源国家药典委员会

微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数

当本法用于检查非无菌制剂及其原辅?#31995;?#26159;否符合规定的微生物限度标准时应按下述规定进行检验包括样品的取样量和结果的判?#31995;取?#38500;另有规定外本法不适用于活菌制剂的检查

本检查法可采用替代的微生物检查法包括自动检测方法但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法

微生物计数试验应在受控洁净环境下的?#26893;?#27905;净度不低于B 级的单向流空气区域内进行检验全过程必须?#32454;?#36981;守无菌操作防止再污染防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出单向流空气区域工作台面及环境应定期进行监测

如供试品有抗菌活性应尽可能去除或中和供试品检查时, 若使用了中?#22270;?#25110;灭活剂应确认其?#34892;?#24615;及对微生物无毒性

供试液制备时如果使用了表面活性剂应确认其对微生物无毒性以及与所使用中?#22270;?#25110;灭活剂的相容性

计数方法

计数方法包括平皿法薄膜过滤法和最可能数法Most-Probable-NumberMethod简称MPN 法MPN 法用于微生物计数?#26412;?#30830;度较差但对于某些微生物污染量很小的供试品MPN 法可能是更适合的方法

供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法所选的方法必须具备检测充足样品量的能力?#21592;?#35777;所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定所选方法的适用性须经确认

计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验

供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查

供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数

若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时计数方法应重新进行适用性试验

表1 试验菌液的制备和使用

 

试验菌株

试验菌液的制备

计数培养基适用性检查

计数方法适用性试验

需氧菌总数

计数

霉菌和酵母

菌总数计数

需氧菌总数

计数

霉菌和酵母

菌总数计数

金黄色葡萄球菌

(Staphylococcus

aureus)

CMCC(B)26 003)

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养培养温度3035棬培养时间1824小时

胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基培养温度30~35棬培养时间不超过3 天接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基/胰酪大豆胨液体培养基MPN 法培养温度3035棬培养时间不超过3 天接种量不大于100cfu

铜绿假单胞菌

Pseudomonas

aeruginosa

CMCCB10 104

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基培养温度3035棬培养时间1824小时

胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基培养温度3035棬培养时间不超过3天接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基/胰酪大豆胨液体培养基MPN 法培养温度3035棬培养时间不超过3 天接种量不大于100cfu

枯草芽孢杆菌

(Bacillus

subtilis)

CMCC(B) 63 501

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基培养温度3035棬培养时间1824小时

胰酪大豆胨琼脂培养基和胰酪大豆胨液体培养基培养温度3035棬培养时间不超过3天接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基/ 胰酪大豆胨液体培养基MPN法培养温度3035棬培养时间不超过3 天接种量不大于100cfu

白色念珠菌

(Candida

albicans)

CMCC(F) 98 001

沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基培养温度2025棬培养时间23

胰酪大豆胨

琼脂培养基

培养温度3035棬培养时间不超5 天接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基培养温度 20~ 25棬培养时间不超过5天接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养基MPN 法不适用培养温度3035棬培养时间不超过5 天接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基培养温度 20 25棬培养时间不超过5天接种量不大于100cfu

黑曲霉

(Aspergillus niger)

CMCC(F) 98 003

沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养温度2025棬培养时间57天或直到获得丰富的孢子

胰酪大豆胨琼脂培养基培养温度3035棬培

养时间不超

5 天接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基培养温度 20 25棬培养时间不超过5天接种量不大于100cfu

胰酪大豆胨琼脂培养MPN 法不适用培养温度3035棬培养时间不超过5 天接种量不大于100cfu

沙氏葡萄糖琼脂培养基培养温度 2025棬培养时间不超过5天接种量不大于100cfu

注当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时应进行培养基适用性检查检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基

菌种及菌液制备

菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代并采用?#23460;?#30340;菌种保藏技术进行保存?#21592;?#35777;试验菌株的生物学特性计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1

菌液制备 按表1 规定程序培养各试验菌株取金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌的新鲜培养物用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成?#23460;?#27987;度的菌悬?#28023;?#21462;黑曲霉的新鲜培养物加入35ml 含0.05聚山梨酯80 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶?#28023;?#23558;孢子洗?#36873;?#28982;后采用?#23460;?#30340;方法吸出孢?#26377;?#28082;至无菌试管内用含0.05聚山梨酯80 的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成?#23460;?#27987;度的黑曲霉孢?#26377;?#28082;

菌液制备后若在室温下放置应在2 小时内使用若保存在28棬可在24小时内使用稳定的黑曲霉孢?#26377;?#28082;可保存在28棬在验证过的贮存期内使用

阴性对照

为确认试验条件是否符合要求应进行阴性对照试验 阴性对照试验应无菌生长如阴性对照有菌生长应进行偏差调查

培养基适用性检查

微生物计数用的成品培养基由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查

按表 1 规定接?#26893;?#22823;于100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板置表1 规定条件下培养

每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2 范围内且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致被检液体培养基管与对照培养基管比较试验菌应生长良好

计数方法适用性试验

供试液制备

根据供试品的理化特性与生物学特性,采取?#23460;?#30340;方法制备供试液供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45档供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1 小时

常用的供试液制备方法如下如果下列供试液制备方法经确认均不适用应建立其他?#23460;?#30340;方法

水溶性供试品 取供试品用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲?#28023;?#25110;pH7.2 磷酸盐缓冲?#28023;?#25110;胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10 供试液

若需要调节供试液pH 值至68必要时用同一稀释?#33322;?#20379;试?#33322;?#19968;步10倍系列稀释水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液

水不溶性非油脂类供试品 取供试品用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲?#28023;?#25110;pH7.2 磷酸盐缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10 供试液分散力较差的供试品可在稀?#22270;?#20013;加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80使供试品分散均?#21462;?#33509;需要调节供试液pH 值至68必要时用同一稀释?#33322;?#20379;试?#33322;?#19968;步10 倍系列稀释

油脂类供试品 取供试品加入经过滤除菌的十四烷酸异丙酯使溶解或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80 或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混?#21462;?#34920;面活性剂的温度一般不超过40棨特殊情况下最多不超过45棩小心混合若需要可在水浴中进行然后加入预热的稀?#22270;?#20351;成110供试?#28023;?#20445;温混合并在最短时间内形成乳状液必要时用含?#23460;?#27987;度的无菌聚山梨酯80 或其他无抑制性无菌表面活性剂的稀?#22270;?#36827;一步10 倍系列稀释

需用特殊方法制备供试液的供试品

膜剂供试品 取供试品,剪碎,加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲?#28023;?#25110;pH7.2磷酸盐缓冲?#28023;?#25110;胰酪大豆胨液体培养基浸泡振摇制备成110 的供试液若需要调节供试液pH 值至68必要时用同一稀释?#33322;?#20379;试?#33322;?#19968;步10倍系列稀释

肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品加入pH6.8 无菌磷酸盐缓冲?#28023;?#29992;于肠溶制剂或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲?#28023;?#29992;于结肠溶制剂置45水浴中,振摇,使溶解,制备成110 的供试液必要时用同一稀释?#33322;?#20379;试?#33322;?#19968;步10倍系列稀释

气雾剂喷雾剂供试品 取供试品,置冰冻室冷冻约1 小时取出迅速消毒供试品开启部位用无菌钢锥在该部位钻一小孔放至室温并轻轻转动容器使抛射剂缓缓全部释出用无菌注射器?#29992;?#19968;容器中吸出全部药液于无菌容器中混合然后取样检查

贴膏剂供试品 取供试品,去掉防粘层将?#31243;?#38754;朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上在?#31243;?#38754;上覆盖一层?#23460;?#30340;无菌多孔材料如无菌?#24202;E?#36991;免贴膏剂?#31243;?#22312;一起将处理后的贴膏剂放入盛有?#23460;?#20307;积并含有表面活性剂如聚山梨脂80 或卵?#23383;?#31232;释液的容器中振荡至少30 ?#31181;ӡ?#24517;要时用同一稀释?#33322;?#20379;试?#33322;?#19968;步10 倍系列稀释

接种和稀释

按下列要求进行供试液的接种和稀释,制备微生物回收试验用供试液所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%为确认供试品中的微生物能被充分检出首先应选择最低稀?#22270;?#30340;供试?#33322;?#34892;计数方法适用性试验

1 试验组 取上述制备好的供试?#28023;?#21152;入试验菌?#28023;?#28151;匀使每1ml供试液或?#31354;?#28388;膜所?#26031;?#30340;供试液中含菌量不大于100cfu

2 供试品对照组 取制备好的供试液, 以稀释液代替菌?#21644;?#35797;验组操作

3菌液对照组 取不含中?#22270;?#21450;灭活剂的相应稀释液替代供试液,按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验

若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀?#22270;?#30340;供试?#33322;?#34892;方法适用性试验时应采用?#23460;?#30340;方法对供试?#33322;?#34892;进一步的处理如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除供试液可经过中和稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌悬?#33322;?#34892;方法?#35270;?#24615;试验

抗菌活性的去除或灭活 供试?#33322;?#31181;后按下列微生物回收规定的方法进行微生物计数若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%可采用下述方法消除供试品的抑菌活性

增加稀释液或培养基体积

加入?#23460;?#30340;中?#22270;?#25110;灭活剂

中?#22270;?#25110;灭活剂表2可用于消除抗菌剂的抑菌活性 最好在稀?#22270;?#25110;培养基灭菌前加入若使用中?#22270;?#25110;灭活剂试验中应设中?#22270;?#25110;灭活剂对照组即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作以确认其?#34892;?#24615;和对微生物无毒性中?#22270;?#25110;灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.52范围内

表2 常见干扰物的中?#22270;?#25110;灭活方法

 


采用薄膜过滤法

上述几种方法的联合使用

若没有?#23460;?#28040;除供试品抑菌活性的方法对特定试验菌回收的失败表明供试品对该试验菌具有抗菌活性同时也表明供试品不可能被该类微生物污染但是供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用而对其他菌株没有抑制作用

因此根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则在不影响检验结果判断的前提下应采用能使微生物生长的更高稀?#22270;?#30340;供试?#33322;?#34892;计数方法适用性试验若方法适用性试验符合要求应以该稀?#22270;?#20379;试液作为最低稀?#22270;?#30340;供试?#33322;?#34892;供试品检查

供试品中微生物的回收

表1 所列的计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验

微生物的回收可采用平皿法薄膜过滤法或MPN 法

平皿法 平皿法包括倾注法和涂布法表1 中每株试验菌每种培养基至少制备2 个平皿?#36816;?#26415;均值作为计数结果

倾注法 取照上述供试液的制备?#34180;?#25509;种和稀释和抑菌活性的中和或消除制备的供试液1ml置?#26412;?0mm 的无菌平皿中, 注入1520ml 温度不超过45熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基混匀凝固倒置培养

若使用?#26412;?#36739;大的平皿培养基的用量应相应增加按表1 规定条件培养计数

同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数计算各试验组的平均菌落数

涂布法 取1520ml 温度不超过45的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基注入?#26412;?0mm 的无菌平皿凝固制成平板采用?#23460;?#30340;方法使培养基表面干燥若使用?#26412;?#36739;大的平皿培养基用量也应相应增加每一平皿表面接种上述照供试液的制备?#34180;?#25509;种和稀释和抑菌活性的中和或消除制备的供试液不少于0.1ml按表1 规定条件培养计数同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数计算各试验组的平均菌落数

薄膜过滤法  薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于 0.45m,?#26412;?#19968;般为50mm,若采用其他?#26412;?#30340;滤膜,冲洗量应进行相应的调整选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留滤器及滤膜使用前应采用?#23460;?#30340;方法灭菌使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面供试液经薄膜过滤后,若需要用冲洗液冲洗滤膜,?#31354;?#28388;膜每次冲洗量为100ml总冲洗量不得超过1000ml,?#21592;?#20813;滤膜上的微生物受损伤

取照上述 供试液的制备?#34180;?#25509;种和稀释和抑菌活性的中和或消除制备的供试液适量一般取相当于1g1ml 或10cm2 的供试品, 若供试品中所含的菌数较多时供试液可酌情减量加至适量的稀释液中,混匀,过滤用适量的冲洗液冲洗滤膜

若测定需氧菌总数转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上

若测定霉菌和酵母总数转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上

按表1 规定条件培养计数每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数

MPN 法 MPN 法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法仅在供试品需氧菌总数没有?#23460;?#35745;数方法的情况下使用本法不适用于霉菌计数若使用MPN 法按下列步骤进行

取照上述 供试液的制备?#34180;?#25509;种和稀释和抑菌活性的中和或消除制备的供试液至少3 个连续稀?#22270;?#27599;一稀?#22270;度? 份1ml 分别接种至3 管装有910ml 胰酪大豆胨液体培养基中同法测定菌液对照组菌数必要时可在培养基中加入表面活性剂中?#22270;?#25110;灭活剂

接种管置3035培养3 天逐日观察各管微生物生长情况如果由于供试品的原因使得结果难以判断可将?#38665;?#22521;养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基在相同条件下培养12 天观察是否有微生物生长根据微生物生长的管数从表3 查?#21592;?#27979;供试品每1g 或每1ml 中总需氧菌的最可能数

表3 微生物最可能数检索表


注表内所列检验量如改用1g或ml0.1g或ml和0.01g或ml时表内数字应相应?#26723;?0 倍如改用0.01 g或ml0.001 g或ml和0.0001 g或ml时表内数字应相应增加10 倍其余类推

结果判断

计数方法适用性试验中采用薄膜过滤法或平皿法时试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.52 范围内采用MPN法试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内若各试验菌的回收试验均符合要求照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数霉菌和酵母菌总数计数

方法适用性确认时,若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求,那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查

供试品检查

检验量

检验量即一?#38382;?#39564;所用的供试品量gml 或cm2

除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或10ml膜剂为100cm2?#36824;?#37325;药品微量包装药品的检验量可以酌减检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4 丸,膜剂还不得少于4 片

一般应随机抽取供试品取规定容器数混合取规定量供试品进行检验

供试品的检查

按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数霉菌和酵母菌总数的测定

胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数

阴性对照试验 以稀?#22270;链?#26367;供试?#33322;?#34892;阴性对照试验阴性对照试验应无菌生长如果阴性对照有菌生长应进行偏差调查

平皿法

平皿法包括倾注法和涂布法除另有规定外取规定量供试品按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定每稀?#22270;?#27599;种培养基至少制备2个平皿

培养和计数 除另有规定外胰酪大豆胨琼脂培养基平板在3035培养3天沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在2025培养5 天 观察菌落生长情况,点计平板上生长的所有菌落数必要时可?#23454;?#24310;长培养时间至7 天进行菌落计数并报告菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数点计菌落数后计算各稀?#22270;?#20379;试液的平均菌落数按菌数报告规则报告菌数若同稀?#22270;?#20004;个平皿的菌落数平均值不小于15则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上

菌数报告规则 需氧菌总数测定?#25628;?#21462;平均菌落数小于 300cfu 的稀?#22270;?#38665;菌和酵母菌总数测定?#25628;?#21462;平均菌落数小于100cfu 的稀?#22270;?#20316;为菌数报告取两位?#34892;?#25968;字的依据取最高的平均菌落数计算1g1ml 或10cm2 供试品中所含的微生物数

如各稀?#22270;?#30340;平皿均无菌落生长或仅最低稀?#22270;?#30340;平板有菌落生长但平均菌落数小于1 时以1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数

薄膜过滤法

除另有规定外按计数方法适用性试验确认的方法进行供试液制备取相当于1g1ml 或10cm2 供试品的供试?#28023;?#33509;供试品所含的菌数较多时可取?#23460;?#31232;?#22270;?#30340;供试?#28023;?#29031;方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中立即过滤冲洗冲洗后取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养

培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数法?#31354;?#28388;膜上的菌落数应不超过100cfu

菌数报告规则 以相当于 1g1ml 或10cm2 供试品的菌落数报告菌数若滤膜上无菌落生长以1 报告菌数?#31354;?#28388;膜过滤1g1ml 或10cm2 供试品,或1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数

MPN 法

取规定量供试品按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和供试品接种所有试验管在3035培养35 天如果需要确认是否有微生物生长按方法?#35270;?#24615;试验确定的方法进行记录每一稀?#22270;?#24494;生物生长的管数从表3查对每1g 或1ml 供试品中需氧菌总数的最可能数

结果判断

需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数包括真菌菌落数霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数包括细菌菌落数若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求可使用含抗生素如氯霉素庆大霉素的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基如玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数测定使用选择性培养基时应进行培养基适用性检查若采用MPN 法测定结果为需氧菌总数

各品种项下规定的微生物限度标准解释如下

101cfu 可接受的最大菌数为20

102cfu 可接受的最大菌数为200

103cfu 可接受的最大菌数为2000?#26469;?#31867;推

若供试品的需氧菌总数霉菌和酵母菌总数的检查结果均符?#32454;?#21697;种项下的规定判供试品符合规定若其中任何一项不符?#32454;?#21697;种项下的规定判供试品不符合规定

稀释液冲洗液及培养基

见非无菌产品微生物限度检查控制菌检查法通则1106

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品生物制品医?#30772;?#20855;原料辅料及其他品种是否无菌的一种方法若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染

说明

1.微生物限度检查法收载于中国药典一二三部附录中内容基本一致

2.本稿是2010 年版微生物限度检查中细菌霉菌及酵母菌计数的内容修订稿参照ICH 协调案非无菌产品微生物限度检查微生物计数法进行修订

 


 

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