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常見的李斯特菌快速檢測技術


錄入時間:2015-5-19 10:01:55 來源:青島海博生物

當前,李斯特菌快速檢測方法為增菌以后,生化鑒定之前,對樣本進行快速篩選,以縮小檢測范圍,減少檢測任務,提高檢測效率。快速檢測方法主要包括酶底物顯色技術、免疫學和分子生物學檢測三大類。 

1即用培養技術

即用培養基技術則省掉了前期準備工作,可以直接檢測樣品,從而節約了大量人力成本。目前,商業化的固定培養基技術主要有兩種:紙片法和即用平皿法。紙片法是指將顯色培養基固定于紙片上,上方再蓋一層帶有方格的透明薄膜,以方便計數。即用平皿法是指用已倒有培養基的平皿,接種操作與傳統涂板、劃線法一樣。其優點和紙片法一樣,即省掉了前期準備工作,可以直接接種培養。此類產品主要有3MPetrifilm試紙片、良潤生物的MicroFast®測試片、北京陸橋的Easy test 系列產品及綠洲生化的微生物測試片等,已被許多研究被證明與傳統方法的檢測結果無顯著性差別。

2免疫學檢測法

該技術以抗原抗體免疫為基礎,制備特異性克隆抗體檢測細菌。目前國內外李斯特菌快速檢測的此類技術主要包括:酶聯熒光分析法(ELFA)、金標免疫層析技術、流式細胞技術等。

2.1酶聯熒光分析法(ELFA) 

該方法是將李斯特菌抗原與單克隆抗體相結合,然后再將結合有堿性磷酸酶的抗體與李斯特菌抗原結合。通過檢測熒光強度(熒光強度與抗原含量成正比)可推算出樣品中李斯特菌的數量。ELFA 靈敏度比ELISA 高,并省去了ELISA 中的顏色反應,縮短反應時間;但缺點是成本較高,目前主要應用在自動酶聯熒光免疫檢測系統(VIDAS)7

2.2金標免疫層析技術

該技術的原理是將高度特異性抗單增李斯特菌抗原的抗體束縛在色原載體上,且可與固相支撐基質相分離。當檢測樣品中存在李斯特菌時,測試單元的試劑將會被展開,產生肉眼可見的確定性反應。陽性結果會在試紙窗有一指示陽性的檢測線,有效測試還需要進一步確認控制線的存在,若無此線檢測無效。北京良潤生物科技有限公司開發的李斯特菌快速檢測卡,可在5~10 min 完成檢測,樣品處理簡單、操作靈活、運輸方便、不需要其他輔助儀器,結果明顯,是現場檢測的理想方法,尤其是針對食品生產環境、即食食品中李斯特菌的檢測。

3流式細胞術

流式細胞術是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段[6],它可以高速分析上萬個細胞,并能同時從一個細胞中測得多個參數。流式細胞技術檢測微生物主要是基于單個細胞的熒光標記技術,可對樣品中死活菌總數、活菌數或特定細菌進行定量檢測。該檢測技術平均1min 即可得到檢測結果,無需培養和樣品制備,靈敏度可以達到1100CFU,但儀器投入較大,檢測成本相對較高,對樣本的要求高,嚴重的制約這該技術在食品微生物檢測中的應用。

4分子學檢測方法

分子生物學檢測方法主要包括核酸探針雜交技術、PCR 檢測技術等。

4.1 DNA探針檢測技術

DNA 探針法是將條堿基互補的DNA 鏈在適當的條件下雜交,通過檢測樣品與標記性DNA 探針之間形成的雜交分子來檢測樣品中的單增李斯特菌,測定放射性或熒光強度即可得出樣品中單增李斯特菌的個數[8]。隨著探針技術的逐漸成熟,人們將多個DNA 特異性探針固定到芯片上,制成基因芯片,采用熒光標記法提高檢測靈敏度。該技術可同時用于多種不同種類病原菌或毒素的檢測,減少實驗次數,減小工作量。

4.2 PCR 檢測技術

PCR 是近年來廣泛應用的分子生物學檢測方法,在單增李斯特菌的檢測中以其遺傳物質高度保守的核酸序列(常用的靶序列包括hlyactAprfA等)設計引物進行擴增。該方法特異性好,但靈敏度低,對樣品進行前處理后再進行擴增,可以提高檢出率和檢測靈敏度。PCR 技術還可對單增李斯特菌進行定量檢測。國內外目前主要應用的PCR技術包括:實時熒光PCR(Real-time PCR)、多重PCR、恒溫擴增、RT-PCR 方法、IMS-PCR 檢測技術等9

IMS-PCR 檢測技術是將免疫磁珠與PCR 結合,建立新的檢測方法磁免疫PCR。此方法結合免疫磁性和PCR 技術的優點如下:首先,利用免疫磁珠的抗原抗體反應,與單增李斯特菌快速結合,達到濃縮目的,縮短檢測周期;其次,利用PCR 方法良好的特異性克服了免疫磁珠在這方面的不足,提高檢測效率;再次,利用免疫磁珠良好的敏感性,提高PCR 方法的靈敏度。

 

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