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2015版中国药典--无菌检测风险控制


录入时间:2015-9-10 15:10:29 来源监管信息网

无菌检测的风险


假阳性结果呈阳性但污染不是产品所带来的而是其他方面比如测试环境方法人员操作等方面所带来的污染这种结果带来的后果往往是企业花费大量的人力物力和财力去进行长时间的调查调查后却找不到污染的根本原因整批产品遭到报废并且法规禁止不以发现造成污染的根本原因为目的而只是重复测试的行为


假阴性结果?#23460;?#24615;但产品本身是存在微生物污染的是由于微生物受?#25581;?#21046;或伤害没有恢复出来才没有生长这种情况下厂家会释放产品导致的后果有可能是给药后微生物在合适的环境下大量增?#24120;?#30149;人遭受严重的伤害甚至危害到患者的生命而企业则会面临产品召回品牌受损甚至工厂关闭风险


无菌检测环境因素


关于环境因素主要是防止在试验过程中的外?#27425;?#26579;对于检测过程的影响防止假阳性的出现尤其是针对于直接接种法和开放式薄膜过滤法的无菌检测方法外部环境的污染问题就成为无菌试验假阳性的最大可能因此目前封闭式薄膜过滤法应用的越来越多即便如此外部环境的影响仍?#27426;?#20110;样品检测是非常大的风险目前对于环境控制的方法主要有两个B级下的?#26893;A级万级下的?#26893;?#30334;级2010版中国药典操作区域或者隔离器中进行无菌操作如果操作正确的话两种方式均能够给我们的实验室实现近似无菌的操作环境



洁净室中进行无菌检测


对于B级下的A级国内通常是万级下的百级操作区域通常是由层流台来实现的无论是垂直层流还是水平层流都能够满足我们的无菌检验需求但是从工作原理上看生物安全柜并不适合进行无菌试验应该定期对于层流台进行检测尘埃粒子风速?#20004;?#33740;浮游菌等关键技术指标?#21592;?#35777;该系统处于正常的工作状态之中对于万级设施应该将其等同视为生产区洁净室进行控制给?#26893;?#30334;级一个较好的外部环绕环?#24120;?#33021;够更好地保证?#26893;?#30334;级的运行


在实验过程中无菌的保持也非常重要特别是防止交叉污染人员的操作和物品的?#24674;?#31227;动都会造成这样的情况这就对人员的要求非常高特别是对于无菌意识的提高通常是最容易讲但是也最难培训的技能和意识整个检测过程中?#27426;?#35201;注意几个原则


1物品可?#28304;?#27905;净的高级别到?#22270;?#21035;转移但是不可?#28304;ӡ图?#21035;到高级别转移进入洁净室的人员必须经过无菌穿衣验证只有有资质的人员才可以进入洁净室


2手作为交叉污染的媒介应该及时定期对手套使用消毒剂进行清洁如果有微生物污染风险?#32454;?#30340;操作应该及?#20493;?#25163;套和无菌衣进行更换


3所?#34892;?#35201;进入实验操作区域的物品必须在经过?#23454;?#22788;理后才进行操作


4试验过程中?#27426;?#35201;注意人的操作对于气流和待试验物品的污染所有物品的去污染化主要指的是物品的灭菌处理和转移方式对于可以进行高温高压进行过度灭菌的物品应尽量采取使用这种方式如果有双门消毒锅可以直接从无菌室将灭菌完毕的产品取出如果没有双门消毒锅则需要将灭完菌的物品再次通过传递窗传入洁净室如果该物品无法进行高温高?#26500;?#24230;灭菌则尽量通过浸泡的方式?#21592;?#38754;的微生物进行去污染处理如西?#21046;?#35013;的样品和添加剂等如果无法进行浸泡则应该全面地进行消毒剂的喷洒和擦拭进?#22411;?#34920;面的清洁对于传入传递窗的物品的外包?#22467;?#24212;尽量选用玻璃或者不锈钢这一类的材质尽量减少选用软袋类的材质软袋类材质带有大量的褶皱很?#35759;?#25152;有的外表面进行清洁


隔离器中进行无菌检测


对于隔离器它能够提供一个相对较好的操作环?#24120;?#30001;于相对封闭的腔体加上所有的空气进出均通过高效过滤装置所有物?#26041;?#20986;必须经过相应的熏蒸不同于层流台它对于外部环境也没?#24515;?#20040;高的要求对于人员也不需要像洁净室那样?#32454;?#30340;控制但是它所达到的无菌环境的能力要更强于层流台?#27604;?#22312;隔离器中进行无菌检测需要实验人?#20493;?#26080;菌实验有更好的计划性例如?#30475;问?#39564;前需要有一个实验物品的清单防止在实验过程中发现有物品的遗漏而隔离器本身?#27531;?#35201;?#22411;?#25972;的灭菌记录需要定期的维护保养和验证试验



洁净室/隔离器环境监控


单向流空气区工作台面及环境应定期按医药工业洁净室区悬浮粒子浮游菌和?#20004;?#33740;的测试方法的?#20013;?#22269;家标准进行洁?#27426;?#30830;认隔离系统应定期按相关的要求进行验证其内部环境的洁?#27426;?#39035;符合无菌检查的要求日常检验还需对试验环境进行监控

检测对象人员空气设备

检测方法浮游菌?#20004;?#33740;表面微生物尘埃粒子


无菌检测方法因素

当进行产品无菌检查法时应进行方法适用性试验以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时应重新进行方法适用性试验对于无菌检测的方法设计应考虑到过滤性化学兼容性膜的兼容性冲洗液类型及体积潜在抑制问题.


无菌检查是根据是否有微生物在液体培养基中生长来进行判断的培养14天后观察培养基有否变浊


无菌检测方法包括薄膜过滤法开放式无菌检查法及封闭式无菌检查法和直接接种法


对于直接接种法药典中有描述取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中除另有规定外每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不?#20040;?#20110;培养基体积的10%?#23548;?#20013;有两种情况会选择直接接种法一种情况是供试品不可过滤或经过处理后也很难过滤从而不能应用薄膜过滤法还有一种情况是该品种项中要求用直接接种法来进行无菌检查除此之外都应选择薄膜过滤法


直接接种法的主要优点是适用于不可过滤的样品?#34892;?#21307;?#30772;?#26800;的无菌检查用直接接种法会比较方便只需将其浸没在培养基中即可缺点是其属于开放式的操作容器的灭菌处理打开容器样品打开包?#22467;?#25509;种等方面样品容器培养基都与外界环境有直接接触风险包括会有污染的风险造成假阳性的结果药品中或多或少都有一些抑菌的成分如果用薄膜过滤法那么通过滤膜的过滤作用加上后续的冲?#24202;?#39588;可以尽可能的把这些成分冲洗掉这样截留在膜片上的微生物就能得到?#34892;?#30340;恢复而直接接种法做不到这一点微生物得不到?#34892;?#30340;恢复造成假阴性的结果样品直接放在装有培养基的试管或容器中会对实验结果的观察造成?#27426;?#30340;影响因此往往需要后续的再转接?#26041;ڣ?#35266;察不到长菌的情况造成假阴性的结果另外从操作性上直接接种法也有很大的局限性通常里面接种的供试品体积不得超过总体积的10%那简单想一下如果供试品体积比较大再加上检验数量有?#27426;?#30340;要求那么需要用大量培养基来进行培养所以通常来说样品体积超过100ml就不能使用直接接种法从上面的分析可以看出使用直接接种法有很大的局限性所以药典中规定只要供试品性状允许应采用薄膜过滤法


封闭式无菌检查方法设计合理对供试?#28023;?#20914;洗液和培养基的操作全部都是在封闭的环境中进行在结果的可靠性和可重复性上无疑做得更好实验结果出现假阳性?#22270;?#38452;性的几?#23460;?#20302;得多而开放式的方法相对操作风险大所以药典中规定薄膜过滤法应优先采用封闭式



无菌检测设备和实验用品因素


和在普通微生物实验室用到的试验用品有所不同在选择?#23454;?#30340;试验物品的时候需要考虑到无菌室的特殊性不可以影响无菌试验的效果也不可以对实验室区域的环境造成任何可能的风险试验用品的材质必须易于清洁而不会脱落颗粒特别是会接触消毒剂的物品如剪?#19969;?#38218;子和盛放消毒剂的容器不能够被腐蚀?#27604;?#23545;于实验用品外部材料的选择应该尽量避免使用塑料软袋物品的灭菌袋子可以选用双层无纺?#21363;?#23376;或者一次性灭菌袋无菌试验的时候还需要考虑的一个重点就是封闭式无菌检测套?#29627;?#35768;多实验人员?#27531;?#30693;道怎么去选择培养基但是很多人并不了解封闭式无菌检测套筒的工作原理和基本要求


1滤膜的完整性滤膜的完整性需要从两个方面进行考虑一个是滤膜本身的完整性一个是滤膜在装配在塑料滤杯后的完整性前者指的是滤膜表面是否具有不同于标示孔径的微孔的?#27605;|?#20027;要可以通过对滤膜本身进行起泡点试验来得出最大孔径的数值如果得出的起泡点试验数据大于或者小于标称数值那么?#24471;?#35813;滤膜本身的孔径是不符合要求的过大的孔径会造成微生物的漏过过小的孔径会造成微生物在进行过滤的时候压力过大造成微生物的损伤这两种情况都会造成假阴性的结果后者的情况比?#32454;?#26434;主要是由于供应商的生产工艺不良造成的主要表?#36136;?#28388;膜未能装配紧固造成滤膜和滤杯之间会发生存在空隙液体在进行过滤的时候会造成样品未能被滤膜截留而从空隙处流入下游由于微生物未能够被滤膜截留像这种情况?#31361;?#36896;成无菌试验的假阴性


2呼吸器的完整性类似于滤膜的完整性也必须考虑呼吸器内滤膜的完整性和滤膜装配到呼吸器内后的完整性不同的是呼吸器的作用是用于过滤进出无菌检验套筒的气体的它使用的是0.22m的疏水性滤膜它的检验是使?#32654;?#25955;流检测法来证明它的孔?#19969;?#22914;果呼吸器的孔径大于0.22m或者装配时发生的空隙造成的完整性不佳会使得呼吸器失去对空气过滤除菌的效果从而使整个实验过程暴露在试验环境中将实验发生假阳性的风险大大提高


3滤膜的流速测试如果说滤膜的完整性测试证明了滤膜的最大孔径但是这一数值不能够表征过滤的效果那么还需要对滤膜的平均孔径和开孔率的平均效果作一次评估这个时候就必须在标准温度下使用纯化水进行流速的测试来保证滤膜的平均孔径和开孔率受控不会出?#33268;?#33180;孔径过小和开孔?#20160;?#22815;导致过?#25628;?#21147;过大而产生的假阴性


4滤膜的截留率试验同滤膜的流速测试相对应还需要了解滤膜的最小孔径的效果会不会过大而影响截留微生物的效率


5整套无菌检验套筒的完整性在整套套筒装配完成之后还需要对于整套产?#26041;型?#25972;性测试证明所有的粘合超声波焊接和热合焊接工?#25307;?#25104;的产品是封闭式的防止有测漏或者破裂的部分导致无菌试验被外来微生物污染从而造成假阳性的影响


6无菌性市场上确实存在由于灭菌条件的不合理或者包装的损坏造成的非无菌的无菌检测套?#29627;?#22240;此高标准的灭菌工艺和高质量的包装是?#32454;?#30340;无菌检测套筒的必要条件


7微生物恢复生长率试验根据滤膜的种类不同主要是选择环氧乙烷灭菌或者伽马射线灭菌但是这不是简单地进行过度灭菌就达到的因为环氧乙烷灭菌和伽马射线灭菌都会有残留过度的灭菌会使得无菌检验套筒在进行无菌试验时产生假阴性的结果因此?#32454;?#30340;无菌检测套?#19981;?#22312;进行无菌试验的同时进行微生物的恢复生长试验以证明残留的环氧乙烷或者放射性不会对微生物产生明显的影响


8耐压试验通常无菌试验在进行时套筒内气体的体积会被压缩因此在试验过程中会积累较大的压力我?#19988;?#24212;该?#21058;?#22871;筒的耐压性是否这种套筒在试验过程中较大的压力下能够保证原有的完整性并且不会发生爆裂等影响试验的后果以上试验应该由使用者进行试验证明或者由生产厂家的质量保证部门在进行过恰当的检验后出具文件证明


无菌检测培养基因素


应该考虑的可能影响实验结果的因素还包括培养基和冲洗液可以使用干粉培养基自行配制也可以使用成品培养基和冲洗液这两者的正确使用与否直接影响到实验的结果通常会做促生长试验和无菌试验来确认培养基冲洗液的?#34892;?#24615;和无菌性进行无菌实验室通常还会使用?#25581;?#20123;添加剂尤其是对于抑菌性比较强的样品会添加一些酶在培养基或者冲洗液中来抑制残留的抗生素所以这些添加物也是需要保证?#34892;?#24615;和无菌性的当添加物加入到培养基和冲洗液中时必须重新对培养基和冲洗液的?#34892;?#24615;和无菌性重新进行测试无菌性促生长试验结果pH?#23707;?#22806;观通常是需要进行测试的项目


培养基种类包括中国药典2010版中的改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基FTM以及EP/USP/中国药典2015版中的胰酪大豆胨液体培养基TSB用于真菌和需气菌的培养和硫乙醇酸盐培养基FTM厌氧菌和需气菌培养


对于FTM培养基分装至?#23460;?#30340;容器中其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层粉红色不超过培养基深度的1/2在供试?#26041;?#31181;前培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5


培养基适用性实验的无菌性检查?#22909;?#25209;培养基随机取不少于5支瓶置各培养基规定的温度培养14天应无菌生长


灵敏度检查


取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支分别接?#20013;?#20110;100CFU的金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌生孢梭菌各2支另1支不接种作为空白对照培养3天


取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支,分别接?#20013;?#20110;100CFU的枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉各2支另1支不接种作为空白对照培养5天


空白对照不生长接种菌液的培养基应有明显生长


缓冲液的作用包括溶解稀释润湿滤膜冲洗缓冲液无菌性检测的目的是确保冲洗液的无菌性无菌检查中避免由于实验材?#26174;?#25104;假阳性风险


薄膜过滤方法过滤之后培养观察14天没有微生物生长肉眼判断培养基没有浑浊冲洗液被认为是无菌的产品无菌检查同步进行阴性对照

 

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