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肉毒梭菌及肉毒毒素检验征求意见稿


录入时间:2016-2-25 16:14:55 来源青岛海博生物

1  范围  

本标准规定了食品中肉毒梭菌Clostridium botulinum及肉毒毒素botulinum Toxin的检验方法

本标准适用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验

2  设备和材料 

除微生物实验?#39029;?#35268;灭菌及培养设备外其他设备和材料如下

a冰箱25-20;

b天平感量0.1g;

c无菌手术剪镊子试剂勺

d均质器或无菌乳钵

e离心机3000 rpm14000 rpm

f厌氧培养装置

g恒温培养箱351281

h恒温水浴箱371601801

i显微镜10100

jPCR

k电泳仪或毛细管电泳仪

l凝胶?#19978;?#31995;统或紫外检测仪

m核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计

n可调微量移液器0.2µL2µL2µL20µL20µL200µL100µL1000µL

o无菌吸管1.0mL10.0 mL25 .0mL

p无菌锥形瓶100 mL

q培养皿?#26412;?/span>90mm

r离心管50mL1.5mL

sPCR反应管

t无菌注射器1.0mL

u小鼠15g20g每一批?#38382;?#39564;应使用同一品系的KM或ICR小鼠

3  培养基和试剂

除另有规定外PCR试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准水应符合GB/T6682中一级水的规格

3.1  庖肉培养基见附录AA.1

3.2  胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤TPGYT见附录AA.2

3.3  卵黄琼脂培养基见附录AA.3  

3.4  明胶磷酸盐缓冲?#28023;?/span>见附录AA.4

3.5  革兰氏染色?#28023;?/span>见附录AA.5

3.6  10%胰蛋白酶溶?#28023;?/span>见附录AA.6

3.7  磷酸盐缓冲?#28023;?/span>PBS见附录AA.7

3.8  1mol/L氢氧化钠

3.9  1mol/L盐酸

3.10  肉毒毒素诊断血清

3.11  无水乙醇和95%乙醇

3.12  10mg/mL溶菌酶溶液

3.13  10mg/mL蛋白酶K溶液

3.14  3mol/L 乙酸钠溶?#28023;?/span>pH5.2

3.15  TE缓冲液

3.16  引物根据表1中序列合成临用时用超纯水配制引物浓度为10 µmol/L

3.17  10PCR缓冲液

3.18  25mmol/LMgCl2

3.19  dNTPsdATPdTTPdCTPdGCP

3.20  Taq

3.21  琼脂糖电泳级

3.22  溴化?#21494;?#25110;Goldview

3.23  5TBE缓冲液

3.24  6加样缓冲液

3.25  DNA分子量标准

 检验程序

肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序见图1

 

5  操作步骤

5.1  样品制备

5.1.1  样品保存

待检样品除未打开的正常罐头食品和明显膨胀的罐头食品应放25冰箱冷藏直至检验

5.1.2  固态食品  

固体或?#21355;?#28082;体很少的半固态食品以无菌操作称取样品25g放入无菌均质袋或无菌乳钵块状食品用无菌刀剪切碎含水量?#32454;?#30340;固态食品加入25mL明胶磷酸盐缓冲?#28023;?#20083;粉牛肉干?#32676;?#27700;量低的食品加入50mL明胶磷酸盐缓冲?#28023;?#28024;泡30?#31181;?#29992;拍击式均质器拍打2min或用无菌研杵?#24515;?#21046;备样品匀?#28023;?#25910;集备用

5.1.3  液态食品  

液态食品摇匀直接量取25mL检验

5.1.4  样品处理

取样后的剩余样品放25冰箱冷藏直至检验结果报告发出后按感染性废弃物要求进行无害化处理检出阳性的样品应采用压力蒸汽灭菌方式进行无害化处理

5.2  肉毒毒素检测

5.2.1  毒素液制备

取样品匀液约40mL或均匀液体样品25mL放入离心管3000r/min10min20min离心收集上清液分为两份放入无菌试管中一份直接用于毒素检测一份用于胰?#22797;?#29702;后进行毒素检测液体样品保留底部沉淀液约12mL备用

胰?#22797;?#29702;用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节上清液pH6.29份上清液加110%胰酶活力1:250水溶?#28023;?#28151;匀37孵育60min期间间或轻轻摇动反应液

5.2.2  检出试验

5号针头注射器取离心上清液和胰?#22797;?#29702;上清液分别腹腔注射小鼠三只每只0.5mL观察?#22270;?#24405;小鼠48h中毒表现小鼠在24h内出现肉毒毒素中毒典型症状多数在6h内发病和死亡其主要表现为竖毛呼吸困难四肢瘫软?#27663;?#39118;箱式呼吸腰腹部凹陷宛如蜂腰因呼吸衰竭而死亡可初步判定为毒素检出若小鼠在24h后发病或死亡应仔细观察小鼠症状必要时浓缩上清液重复试验以排除肉毒毒素中毒若小鼠出现猝死30min内导致症?#24202;?#26126;显时可将毒素上清?#33322;?#34892;?#23454;?#31232;释重复试验

注毒素检测动物试验应遵循食品毒理学实验室操作规范GB15193.2的规定

5.2.3  ?#20998;?#35797;验

上清液或和胰?#22797;?#29702;上清液的毒素检出试验阳性者取相应试验液三份每份0.5mL其中第一份加等量多型混合肉毒毒素诊断血清混匀37孵育30min第二份加等量明胶磷酸盐缓冲?#28023;?#28151;匀煮沸10min第三份加等量明胶磷酸盐缓冲?#28023;?#28151;?#21462;?#23558;三份混合液分别腹腔注射小鼠各两只每只0.5mL观察96h

结果判定若注射第一份和第二份混合液的小鼠未死亡而第三份混合液小鼠发病死亡并出现肉毒毒素中毒的特有症状则判定检测样品中检出肉毒毒素

5.2.4  毒力测定选做项目

取?#20998;?#35797;验阳性的试验?#28023;?#29992;明胶磷酸盐缓冲?#21512;?#37322;制备?#27426;?#20493;数稀释?#28023;?#22914;1050100500倍等分别腹腔注射小鼠各两只每只0.5mL观察?#22270;?#24405;小鼠发病?#33000;?#20129;情况至96h计算最低致死剂量MLD/mLMLD/g评估样品中肉毒毒素毒力MLD等于小鼠全?#20811;?#20129;的最高稀释倍数乘以样品试验?#21512;?#37322;倍数例如样品稀释两倍制备的上清?#28023;?#20877;稀释100倍试验液使小鼠全?#20811;?#20129;而500倍稀释液组存活则该样品毒力为200MLD/g

5.2.5  定型试验选做项目

根据毒力测定结果用明胶磷酸盐缓冲?#33322;?#19978;清?#21512;?#37322;至101000MLD/mL作为定型试验?#28023;?#20998;别与各单型肉毒毒素诊断血清等量混合国产诊断血清一般为冻干血清用1mL生理盐水溶解能中和10000LD50的相应毒素37孵育30min分别腹腔注射小鼠两只每只0.5mL观察?#22270;?#24405;小鼠发病?#33000;?#20129;情况至96h同时用明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清与试验液等量混合作为小鼠试验对照

结果判定某一单型诊断血清组动物未发病且正常存活而对照组和其他单型诊断血清组动物发病死亡则判定样品中所含肉毒毒素为该型肉毒毒素

未经胰酶激活处理的样品上清液的毒素检出试验或?#20998;?#35797;验为阳性者则毒力测定和定型试验可省略胰酶激活处理试验

5.3  肉毒梭菌检验

5.3.1  增菌培养与检出试验

5.3.1.1  取出庖肉培养基4支和TPGY肉汤管2支隔水煮沸10min-15min排除溶解氧迅速冷却?#24418;?#25671;动在TPGY肉汤管中缓慢加入胰酶液至液体石蜡液面下肉汤中每支1mL制备成TPGYT

5.3.1.2   吸取样品匀液或毒素制备过程中的离心沉淀液2mL接种至庖肉培养基中每份样?#26041;?#31181;42支直接放置351厌氧培养至5d2支放80保温10min再放置351厌氧培养至5d同样方法接种2 TPGYT肉汤管 281厌氧培养至5d接种时将样品?#20309;?#31649;慢慢穿过肉汤液面接种到肉汤管底部?#24418;?#25605;动

5.3.1.3  检查记录增菌培养物的浊度产气肉渣颗粒消化情况并注意气味肉毒梭菌培养物为产气肉汤浑浊庖肉培养基中A型和B型肉毒梭菌肉汤变黑消化或不消化肉粒有异臭味

5.3.1.4  将增菌培养物进行革兰氏染色镜检观察菌体形态注意是否有芽胞芽胞的相对比例芽胞在细胞内的位置

5.3.1.5  若增菌培养物5d无菌生长,应延长培养至10d观察生长情况

5.3.1.6  取增菌培养物阳性管的上清?#28023;?#25353;5.2方法进行毒素检出和?#20998;?#35797;验必要时进行定型试验阳性结果可证明样品中有肉毒梭菌存在

TPGYT增菌液的毒素试验无需添加胰?#22797;?#29702;

5.3.2  分离与纯化培养

5.3.2.1  增菌液前处理吸取1mL增菌液至无菌螺旋帽试管中加入等体积过滤除菌的无水乙醇混匀在室温下放置1h

5.3.2.2  取增菌培养物和经乙醇处理的增菌液分别划线接种至卵黄琼脂平板351厌氧培养48h

5.3.2.3  观察平板培养物菌落形态肉毒梭菌菌落隆起或扁平光滑或?#26893;ڣ?#26131;成蔓延生长边缘不规则在菌落周围形成乳色沉淀晕圈E型较宽AB型较窄用斜视光观察菌落表面?#27663;?#29645;珠样彩虹这种光泽区可随蔓延生长扩散到不规则边缘区外的晕圈

5.3.2.4  菌株纯化培养在分离培养平板上选择5个肉毒梭菌可疑菌落分别接种卵黄琼脂平板351厌氧培养48h5.3.2.3观察菌落形态及其纯度

5.3.3   鉴定试验

5.3.3.1  染色镜检

挑取可疑菌落进?#22411;?#29255;革兰氏染色和镜检肉毒梭菌菌体形态为革兰氏阳性粗大杆菌芽胞卵?#27531;Ρ?#22823;于菌体位于次端菌体呈网球拍状

5.3.3.2  毒素基因检测PCR快速鉴定

a菌株活化挑取可疑菌落或待鉴定菌株接种TPGY351厌氧培养24h

bDNA模板制备吸取TPGY培养液1.4mL至无菌离心管中 14000g离心min弃上清加入1.0mLPBS悬浮菌体14000g离心min弃上清用400µL PBS重悬沉淀加入10mg/mL溶菌酶溶液100µL摇匀37水浴15min加入10mg/mL蛋白酶K溶液10µL摇匀60水浴1h再沸水浴10min14000g离心min上清液转移至无菌小离心管中加入3mol/LNaAc溶液50µL95%乙醇1.0mL摇匀-70或-20放置30min14000g离心10min弃去上清?#28023;?#27785;淀干燥后溶于200µLTE缓冲?#28023;?/span>置于-20C保存备用

注根据实验室?#23548;?#24773;况也可采用常规水煮沸法或商品化试剂盒制备DNA模板

c核酸浓度测定必要时取5µLDNA模板溶?#28023;?#21152;超纯水稀释至1mL用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度?#21697;直?#26816;测260nm280nm波段的吸光值A260A280按式1计算DNA浓度当浓度在0.34µg/mL340µg/mLA260/A280比值在1.71.9之间时?#23460;?#20110;PCR扩增

C= A260N50                     (1)

式中

CDNA浓度单位为µg/mL

A260260nm处的吸光值

N核酸稀释倍数

dPCR扩增

1采用分别针对型和型肉毒梭菌毒素基因设计的特异性引物见表1进行PCR扩增每个PCR反应管检测一种型别的肉毒梭菌

 

 

2反应体系配制见表2反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行相应调整

 

3反应程序预变性95min循环?#38382;?/span>94min60min72min循环数40后延伸7210min4保存备用

4PCR扩增体系应设置阳性对照阴性对照和空白对照用含有已知肉毒梭菌菌株或含肉毒毒素基因的质控品作阳性对照非肉毒梭菌基因组DNA作阴性对照无菌水作空白对照

e凝胶电泳检测PCR扩增产物用0.5TBE缓冲液配制1.21.5的琼脂糖凝?#28023;?#20957;胶加热融化后冷却至60左右加入溴化?#21494;?#33267;0.5µg/mLGoldview5µL/100mL制备胶块取10µLPCR扩增产物与2.0µL6加样缓冲液混合点样其中一?#20934;?#20837;DNA分子量标准0.5TBE电泳缓冲?#28023;?/span>10V/cm恒压电泳根据溴酚蓝的移动位置确定电泳时间用紫外检测仪或凝胶?#19978;?#31995;统观察?#22270;?#24405;结果

PCR扩增产物也可采用毛细管电泳仪进行检测

f结果判定阴性对照和空白对照均未出现条带阳性对照出现预期大小的扩增条带表1判定本次PCR检测成立待测样品出现预期大小的扩增条带判定为PCR结果阳性根据表1判定肉毒梭菌菌株型别待测样品未出现预期大小的扩增条带判定PCR结果为阴性

5.3.3.3  菌株产毒试验

PCR阳性菌株或可疑肉毒梭菌菌株接种庖肉培养基或TPGYT肉汤用于E型肉毒梭菌按5.3.1.2条件厌氧培养5d5.2方法进行毒素检测和或定型试验毒素?#20998;?#35797;验阳性者判定为肉毒梭菌根据定型试验结果判定肉毒梭菌型别

注根据PCR阳性菌株型别可直接用相应型别的肉毒毒素诊断血清进行?#20998;?#35797;验

6  结果报告

6.1  肉毒毒素检测结果报告

根据5.2.3?#20998;?#35797;验结果报告25g(mL)样品中检出或未检出肉毒毒素

根据5.2.5定型试验结果报告25g(mL)样品中检出某型肉毒毒素

6.2  肉毒梭菌检验结果报告

根据5.3.3.2 PCR检测结果阴性报告样品中未检出肉毒梭菌

根据5.3.3.3菌株产毒试验结果报告样品中检出肉毒梭菌或某型肉毒梭菌或未检出肉毒梭菌

 

 

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