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病原微生物快速检测方法及研究进展


录入时间:2016-3-1 16:45:38 来源青岛海博生物

    进入21 世纪以来,感染性疾病仍然是危害人类健康的重大隐患,尤其是第三世界国家WHO 宣布近30 年来,新发现了29 ?#20013;?#30149;原体目前的现状是造成感染性疾病的微生物种类日益复杂,常见病原微生物的威胁不仅没有消除,而?#39029;?#29616;了一些耐药性菌株,如葡萄球菌肠球菌铜绿假单胞菌大肠杆菌等,加之一些新病原体的出现,给临床诊断和治疗带来了很大的困难2003 SARS 引起了全球性灾难和恐慌,今年又接连发生禽流感爆发猪链球菌感染人类和牛炭疽感染人类?#24405;?/span>,出现?#38382;?#36234;来越频繁等严峻的?#36136;?#32473;病原微生物的检测和诊断提出了更高的要求,同时,对病原菌的明确诊断也是合理用药的基础因此,研究和发展各种病原微生物的检测技术,准确快捷地确认与检测病原体,对感染性疾病的治疗和预后有重要意义

应用生化方法对病原微生物进行检测

   生化方法检测病原微生物?#23548;?#19978;是测定微生物特异性酶由于各种微生物所具有的酶系统不完全相同,对许多物质的分解能力亦不一致因此可利用不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生物内酶的有无,从而达到检测特定微生物的目的如沙门氏菌能产生辛酯酶,这一性能是除沙门氏菌外的各属肠杆菌科细菌所不具备的根据这一特性,甄宏太等[1 ] 报道了快速检测沙门氏菌的辛酯酶法该方法是以42甲基伞形酮辛酯(MUCAP) 为底物,经沙门氏菌的酶降解后,释放出4MU ,在紫外灯下观察其发出的蓝色荧光该方法简便易行,从加入底物到紫外灯下观察到出结果仅需几?#31181;?#21363;可完成其灵敏度和特异性分别可达95 %90 %[2 ] ?#26434;?/span>HS( + ) 反应的沙门氏菌该法更为敏感,灵敏度和特异性均接近100 %[ 3 ] 大肠埃希氏菌具2葡萄糖醛酸酶,但以O157 : H7 为代表的肠出血性大肠埃希氏菌( EHEC) ?#24202;?#20855;此酶,2葡萄糖醛酸酶阴性已成为初步筛查EHEC 的重要特征白色念珠菌具脯氨酸肽酶及N2已酰2半乳糖苷酶,分别以合适的试剂检测,两酶均阳性即为白色念珠菌

血清免疫学方法

   免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应,观察和研究组织细胞特定抗原(抗体的定性和定量技术为了显示和观察这种抗原抗体反应,需要预先将?#25345;?#26631;记物结?#31995;?#25239;体上,借标记物的荧光或酶的有色反应放射性或高电?#29992;?#24230;,在光镜或电镜下进行定性定位或定量研究各?#20013;问?#30340;免疫分析方法如放射免疫分析(RIA) 酶免疫分析( EIA) 间?#29992;?#32852;免疫吸附( EL ISA) 荧光免疫分析( FIA) 生物发光免疫分析(BIA) 化学发光免疫分析(CIA),直接检测微生物或通过间接检测微生物的成份及微生物代谢产物(如毒素检出微生物各大文?#36164;?#25454;库提供的数据显示,几乎建立了所有病原体的血清学检测方法,表明该方法也成为了一种实验?#39029;?#29992;的成熟的检测技术

2. 1 荧光抗体技术

   荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的特异性,把荧光素作为抗原标记物,在荧光显微镜下检查?#27663;?#33639;光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位荧光抗体技术的主要特点是特异性强速度快灵敏度高,但?#27850;?#22312;许多的缺点,如非特异染色问题难以完全解决操作程序较烦琐需要特殊的昂贵仪器(荧光显微镜和染色标本不能长期保存等用于快速检测病原菌的荧光抗体技术主要有直接法?#22270;?#25509;法直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清,经洗涤后在荧光显微镜下观察结果间接法是在检测样品上滴加已知的细菌特异性抗体,待作用后经洗涤,再加入荧光标记的第二抗体如市场上广泛应用的抗沙门氏菌荧光抗体和猪瘟荧光抗体吕治林等[4 ] 报道的由美国同行所作的用炭疽杆菌细胞壁(CW2DFA) ?#22270;?#33180;抗原(CAP2DFA) 特异的荧光标记的单克隆抗体,可快速鉴别炭疽杆菌

2. 2 酶免疫技术

   酶联免疫技术是根据抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理有机结合,通过?#22797;?#21270;底物进而发生一系列的化学反应,使溶液?#27663;?#20986;颜色变化,从而显?#31350;?#21407;抗体特异性反应的存在酶联免疫技术的应用,大大提高了检测的敏?#34892;?#21644;特异性,现已被广泛地应用于多种病原微生物的检测应用单克隆抗体结合硝酸纤维膜上的斑点EL ISA 技术,已成功地自患者的?#36866;?#26631;本?#22411;?#26102;检出可能存在的肺?#23383;?#21407;体流感病毒副流感病毒呼吸道合胞病毒和型腺病毒?#21487;?#21326;等[ 5 ] MP 膜结?#31995;?#30333;抗原制备MP 单抗来建立双抗体夹心EL ISA 检测肺?#23383;?#21407;体抗原方法PCR 方法的符?#19979;?#36798;95 %; Gehring [6 ] 用酶联免疫化学发光法( EL IMCL) 测定大肠杆菌O157 H7 ,PBS 缓冲液中,检测极限约为7. 6 10个活细胞许多疾病的检测?#23478;?#26377;商品化的试剂盒出现如直接自尿中检出沙眼衣原体的商品试剂盒IDEIA

分子生物学方法

   分子生物学及分子遗传学的发展,使人们对微生物的认识逐渐从外部结构特征转向内部基因结构特征,微生物的检测也相应的从生化免疫方法转向基因水平的检测

3. 1 核酸杂交法

   最初应用于微生物检测的分子生物学技术是基因探针方法,它是用带?#22411;?#20301;素标记或非同位素标记的DNA RNA 片?#21355;?#26816;测样本中某一特定微生物核苷酸的方法

   核酸杂交有原位杂交打点杂交斑点杂交Sort hern 杂交Northern 杂交等,它们共同的特点是: (1) 都是应用复性动力学原理; (2) 都必须有探针的存在核酸分子探针又可根据它们的来源和性质分为DNA 探针cDNA 探针RNA 探针及人工合成的寡聚核苷酸探针等该法诊断的原理是通过标记根据病原体核酸片段制备的探针与病原体核酸片段杂交,观察是否产生特异的杂交信号核酸探针技术具有特异性好敏?#34892;?#39640;诊断速度快操作较为简便等特点目前,已建立了多种病原体的核酸杂交检测方法,尤其是近年来发展起来的荧光原位杂交技术(FISH) 更为常用[7 ,8 ] 

3. 2 PCR 及其衍生技术

   PCR 技术又称体外扩增技术,1985 年发明以来,因其高度灵敏性和良好的特异性受到了人们的高度重视,短短20 年的时间,各种各样以PCR 为基础的DNA 序列的扩增和检测方法得到?#25628;该?#21457;展,几乎已应用于基础研究的各个领域,并?#39029;?#20026;医学临床和检验部门强有力的分析工具各种衍生技术如反转录PCR ( RT2PCR) 多重PCR[9 ] 巢式PCR[10 ] PCR 单链构象多态性( PCR2SSCP ) RFL P[11 ] RAPD 技术荧光定量PCR[12 ] 等其中定量PCR 既可以用于临床感染性疾病的诊断,又可用于监测其疗效而DNA 测序分析可用于病原菌的鉴定和亚型的区分,以及同种病原菌不同菌株的区分

3. 3 基于16S rRNA Gya B 的检测技术

   随着测序技术发展,DNA 大规模测序得以进行,传统的依据形态学生物化学特征鉴定细菌的方法,在某些方面将可以被一种可定量较精确的以可翻译核苷酸序列为基础的分析方法所取代以核苷酸序列为基础的方法,要求选择合适的靶基因进行比较分析

3. 3. 1 16S rRNA 为靶基因进行检测自Woese 等于1987 年首次运用rRNA 分析以来,

rRNA 数据库快速扩大起来,其成为研究细菌多样性进化系统发育中被广泛采用的序列16S

rRNA 存在于所有原核生物细胞中,它们相对稳定且有?#32454;?#30340;拷贝数(每个细胞?#30422;?#20010;拷贝) ,其序列中含可变区及高度保守区,因此可设计群属种特异性的探针现阶段各种常见细菌的16S rRNA 基因几乎全部测序完成,16S rRNA 编码基因的这些特点使之成为较理想的细菌基因分类的?#34892;?#21015;,逐渐成为细菌鉴定分类的金标准目前, 16SrRNA 检测技术已在医学界得到广泛应用,可以用现有病原菌标准菌株制作DGGE (变性梯度凝胶电泳标准marker , 然后对疑似病原菌扩增16SrRNA 进行DGGE 分析,这样可以做到快速检测

3. 3. 2 Gya B 为靶基因进行检测以16SrRNA 为靶标分析研究?#27850;?#22312;着一些问题如序列

联配时必须考虑到rRNA 二级结构各细菌中rRNA 基因拷贝数不同; rRNA 多拷贝的微生物中

不同拷贝具有异质性等,使得其不能很好地区分密切相关的菌种

   促旋酶(gyrase) B 亚单位基因GyaB 除?#21496;?#26377;16S rRNA 所具有的优点外,其基因进化率高于核糖体基因,还有GyaB 在近乎全部细菌中?#23454;?#25335;贝?#38382;健?#26377;研究表明,基于GyaB 序列构建的进化图谱与基于DNA2DNA 杂交的相一致因此, GyaB的分析特别适合于菌株的区别?#22270;?#23450;Fukushima[13 ] Gya B 基因为靶基因设计基因芯片来检测?#31181;?#26438;菌属,实验结果显示此芯片鉴别?#31181;?#26438;菌达到种水平,并且能区别密切相关的菌种,如牛?#31181;?#26438;菌和结核?#31181;?#26438;菌,这对临床治疗具有重要的参?#25216;?#20540;而采用16S rRNA 序列数据构建的DNA 探针阵列?#24202;?#33021;区别密切相关的?#31181;?#26438;菌菌种[14 ] Yamamoto [15 ] 的报道与Fukushima 等的相一致,说明分析Gya B 基因序列对于在菌种水平鉴别细菌是快速而?#34892;?#30340;方法

分子生物学与免疫学相结合的方法

4. 1 免疫PCR

   免疫PCR(immuno polymerase chain reaction ,IM PCR) 1992 Sano [16 ] 建立的一种检测微

量抗原的高灵敏度技术该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏?#34892;?#26377;机结合起来,它的基本原理是用?#27426;?#24050;知DNA 分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应, PCR 扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA 分子,电泳定性,根据特异性PCR 产物的有无,来判断待测抗原是否存在目前,国内外报道的免疫PCR 的敏?#34892;?#19968;般?#35748;中?#30340;EL ISA 法高1010[17 ] 由于PCR 产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比,因此免疫PCR 还可用于抗原的半定量试验

4. 2 PCR2EL ISA

   PCR2EL ISA 法是PCR EL ISA 技术结合的检测方法其综合了PCR ,分子杂交,EL ISA 3

种技术的优点主要用于检测样品中的特定基因它引入地高辛(或生物素标记的dN TP 或引物进行PCR 扩增,利用酶标抗地高?#37327;?#20307;(或酶标记亲和素进行EL ISA 检测,代替了用于常规PCR 产物检测的电泳方法,方便快捷,易于处理大量样品,且其灵敏度比使用琼脂糖凝胶电泳检测方法高100,当有?#23454;?#30340;标准品时,还可进行定量测定[18 ] 

用生物传感器进行病原微生物的鉴定

   生物传感器是将新兴的传感器技术和分子诊断技术相结合而成的一?#20013;?#25216;术,是现代临床诊断发展的一个新方向生物传感器包含两部分,即分子识别器件和换能器在待测物识别器件以及转换器件之间由一些生物化学生化作用或物理作用过程彼此联系由于生物传感器检测准确操作简便等特点,近年来已经在许多领域取得了很大的进展,在生物分子相互作用药物筛选临床诊断食物检测等领域获得?#26031;?#27867;的应用其中临床中用于病原体检测的以DNA 生物传感器最为常见葛晶等[ 19 ]利用大肠杆菌抗体的免疫吸附反应,使用集成化SPR 传感器快速检测大肠杆菌O157 : H7 ,采用亲和素生物素系统放大检测的反应信号,并引入复合抗体作为二次抗体,使?#20040;?#24863;器对大肠杆菌的检测限由10cfu/ ml 下?#26723;?/span>10cfu/ ml Masarova [20 ] 用凝集

素代替抗体用生物传感器进行细菌鉴定,实验证明该法在病原菌检测中有很大的优势华裔科学?#39029;?#24314;柱最新制成的生物传感器,仅需20s 时间即可检测出微量SARS 病毒天花病毒及炭疽杆菌等的存在,从而达到可早期诊断出SARS 病毒感染者尽管生物传感器作为一?#20013;?#30340;传?#24615;?#20214;近年来得到了很大的发展,许多光化学电化学以及压电晶体都相继在生物传感器中得?#25509;?#29992;与常规的核酸和蛋?#23383;?#26816;测相比,具有检测准确操作简单等特点,但由于它存在灵敏度不够容?#36164;?#26434;质干扰等缺点,随着研究的进一步深化?#22270;?#26415;方法的改进,这些问题将会得到解决

生物芯片

   生物芯片技术是将生物大分子,如寡核苷酸cDNA基因组DNA肽抗原以及抗体等固定在诸如硅片玻璃片塑料片凝胶和尼龙膜等固相介质上形成生物分子点阵,当待测样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后,利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析根据生物芯片上探针的分子种类而将之分为DNA 芯片(即基因芯片和蛋?#23383;市?#29255;微生物检测基因芯片是指?#32654;?#26816;测样品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片基于高通量微型化和平行分析的特点,微生物检测基因芯片在微生物病原体检测种类鉴定功能基因检测基因分型突变检测基因组监测等研究领域中发挥着越来越重要的作用

   目前,许多细菌病毒等病原体的基因组测序已经完成,将许多代表各种微生物的特殊基因制成1张芯片,经反转录就可检测样本中有无病原体基因的表达及表达水平,由此判断病人感染病原感染进程以及宿主反应等这样就大大提高了检测效率基因芯片诊断病原菌的原理基于细菌的16S rRNA基因的高度保守性,由于RNA 易于降解,因此多采用检测16S

   rRNA 所?#26434;?#26579;色体上的16S rDNA 序列对16S rDNA 而言,如果出现个碱基以上的差异就可以断定细菌不属于同一种属,因此可用于细菌的分类?#22270;?#21035;对病毒和耐药性病原菌的检测是通过将待测的特定基因(病毒特异性基因和耐药基因经体外转录PCR逆转录末端标记等处理成标记有荧光分子的核酸分子,然后与芯片上的探针进行杂交,用计算机对杂交信号进行处理,依信号和强度即可得出核酸含量

   目前,生物芯片技术?#24418;?#25104;熟,还存在着诸如技术成本高芯片制备较为复杂样品准备与标记比较繁琐信号检测的灵敏度有待提高等许多问题尽管如此,它在预防疾病方面开辟了一条新途径

蛋?#23383;?#25351;纹图谱技术

   蛋?#23383;?#25351;纹图谱技术是随着蛋?#23383;?#32452;学兴起的一?#20013;?#25216;术,用于各种疾病特异性蛋?#23383;?#32441;的识别和判断,可以直接检测不经处理的尿液血液或细胞裂解液等人体血清里有成千上万个蛋白,人一旦发生了?#25345;?#30142;病,蛋?#23383;食?#20998;就必然会起变化中科院微生物所唐宏研究员等利用蛋?#23383;?#36136;?#23383;?#32441;图谱最新技术及其检测办法,可以分析得出SARS与非SARS 病?#25628;?#28165;中的蛋?#23383;食?#20998;变化该技术不是利用单独的蛋?#23383;?#23792;的出现和消失来判断SARS ,而是用个蛋?#23383;?#23792;的出现和消失来判断,好比刑侦破案中甄别个?#31181;?#30340;指纹,故此称为指纹图谱质谱仪通过复杂的计算能?#24739;亲?/span>SARS病?#25628;?#28165;里蛋?#23383;?#30340;图谱,通过对质谱仪的?#25226;?#32451;之后,它就能够根据人体血清中的特异变化,灵敏地辨别出测试的对象是否感染了SARS 病毒这种

检测方法经?#26412;?#22825;坛医院临床检测,阳性?#24335;?#36817;95 % ,特异性将近96 %,能在病人发烧的第一天即可以得出满意的检测结果只需要一滴血,将采集到的病?#25628;?#26679;现场直接放到9mol 浓度的尿素里,病?#31350;?#20197;迅速溶解灭活,这样在一般医院的化验室里即可实现安全操作,从而防止交叉感染有专?#39029;频字?#25351;纹图谱技术标志着一种划时代的诊断模式的诞生

结论与展望

   综上所述,病原的检测方法多种多样,各种方法都有其优缺点,为了?#26893;?#21508;自的不足,进一步提高灵敏度和特异性,可以采用多种方法联合使用的策略选择检测方法应考虑到自身所拥有的条件,检测所要求达到的灵敏度,而提高灵敏度和去除假阳性是检测方法发展的趋势

   近年来,随着计算机技术的?#27426;?#21457;展,临床病原菌检测将向着高度自动化和开发简便的快速检测技术两个方向发展分子生物学技术通过自动化仪器的使用,将在病原菌诊断鉴定和耐药基因检测方面逐?#25509;?#29992;于临?#30149;?#29983;物芯片技术的发展和应用,最终将彻底改变临床病原菌检验的现状和传统观念,实现高效高质和廉价的统一随着各学科的交叉发展,会出现越来越多的新的检测技术

 

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