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单核细胞增生李斯特氏菌检验(征求意见稿)一


录入时间:2016-3-30 15:49:22 来源青岛海博生物

1. 范围

本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes的检验方法

本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验第二法适用于单核细胞

增生李斯特氏菌含量?#32454;?#30340;食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数第三法适用于单核细胞增

生李斯特氏菌含量?#31995;?#32780;杂菌含量?#32454;?#30340;食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数

2. 设备和材料

: 除微生物实验?#39029;?#35268;菌及培养设备外其他设备和材料如下

2.1  冰箱2 5

2.2  恒温培养箱30 1 36 1 20 1

2.3  均质器

2.4  显微镜10100

2.5  电子天平感量0.1 g

2.6  锥形瓶100 mL500 mL

2.7  无菌吸管1 mL0.01 mL刻度10 mL0.1 mL刻度或微量移液器及吸头

2.8  无菌平皿?#26412;?/span>90 mm

2.9  无菌试管16 mm160 mm

2.10  离心管30 mm100 mm

2.11  无菌注射器1 mL

2.12  单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes ATCC19111CMCC54004英诺克

李斯特氏菌Listeria innocua ATCC33090伊氏李斯特氏菌Listeria ivanovii ATCC19119斯氏李斯特氏菌Listeria seeligeri ATCC35967或具相同效果的标准株

2.13  金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923或其他产-溶血?#26041;?#33889;菌

2.14  马红球菌Rhodococcus equi ATCC6939NCTC1621

2.15  小?#36164;?/span>ICR体重18 g22 g 

2.16  全自动微生物生化鉴定系统

3  培养基和试剂

3.1  0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤TSB-YE见附录AA.1

3.2  0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂TSA-YE见附录AA.2

3.3  李氏增菌肉汤LBLB1LB2见附录AA.3

3.4  1%盐酸吖啶黄acriflavine HCl溶?#28023;?#35265;附录AA.3.2.1A.3.2.2

3.5  1%萘啶酮酸钠盐naladixic acid溶?#28023;?#35265;附录AA.3.2.1A.3.2.2

3.6  PALCAM琼脂见附录AA.4

3.7  ALOA (Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti)脂见附录AA.5

3.8  革兰氏染?#28023;?#35265;附录AA.6

3.9  SIM动力培养基见附录AA.7

3.10  缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红MRV-P试验用]见附录AA.8

3.11  5%8%羊血琼脂见附录AA.9 

3.12  糖发酵管见附录AA.10

3.13  过氧化氢试剂见附录AA.11

3.14  李斯特氏菌显色培养基

3.15  生化鉴定试剂盒全自动微生物鉴定系统

3.16  缓冲蛋白冻水见附录AA.12


第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验

4.  检验程序

单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1

 

5  操作步骤

5.1  增菌

以无菌操作取样品25 gmL加入到含有225 mL LB1增菌液的均质袋中在拍击式均质器上连续均质1 min2 min或放入盛有225 mL LB1增菌液的均质杯中8000 r/min10000 r/min均质1 min2 min于30 1 培养24 h2 h移取0.1 mL转种于10 mL LB2增菌液内30 1 培养18 h24 h

5.2  分离

LB2 二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色或ALOA平板和PALCAM琼脂平板于36 1 培养24 h48 h观察各个平板上生长的菌落典型菌落ALOA琼脂平板上为蓝绿色菌落周围有不透明晕圈PALCAM琼脂平板上为小的?#27531;?#28784;绿色菌落周围有棕黑色水解圈?#34892;?#33740;落有黑色凹陷李斯特氏菌显色平板的菌落特征参照产品说明进行判定

     注 ALOA平板上的典型菌落单核细胞增生李斯特氏菌或伊氏李斯特氏菌如果ALOA平板菌落不典型可继续培养48 h再观察部分菌株不产生透明晕圈

5.3  初筛

自选择性琼脂平板上分别挑取3个5个典型或可疑菌落在TSA-YE平板上划线纯化, 于36 1 培养18 h24 h,分别接种在木糖鼠李糖发酵管于36 1 培养24 h2 h选择木糖阴性鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定

5.4  鉴定

5.4.1 染色镜检李斯特氏菌为革兰氏阳性?#35848;?#33740;大小为0.4 m0.5 m0.5 m2.0 m用生理盐水制成菌悬?#28023;?#22312;油镜或相差显微镜下观察该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动

5.4.2 动力试验挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或SIM动力培养基2530培养48h李斯特氏菌有动力在半固体或SIM培养基上方呈伞状生长伞状生长不明显可继续培养5d,再观察结果

5.4.3 生化鉴定挑取纯培养的单个可疑菌落进行过氧化氢酶试验过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1

5.4.4 溶血试验新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个25个小格挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上每格刺种一个菌落并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌伊氏李斯特氏菌斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)穿刺?#26412;?#37327;接近底部但不要触到底面同时避免琼脂破裂36 1 培养24 h48 h于明?#38142;?#35266;察单增李斯特氏菌?#27663;?#29421;窄清晰明亮的溶血圈斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生的透明溶血英诺克李斯特氏菌无溶血伊氏李斯特氏菌产生宽的轮廓清晰的-溶血区域若结果不明显可置4冰箱24 h48 h再观察

    注也可用划线接种法

5.4.5 协同溶血试验 cAMP(可选项目)在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间垂直线两端不要触及平行线距离1mm2mm同时接种单核细胞增生李斯特氏菌英诺克李斯特氏菌伊氏李斯特氏菌斯氏李斯特氏菌36 1 培养24 h48 h单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm的-溶血增强区域斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm10mm的?#20985;?#22836;状?#23453;?溶血增强区域英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象若结果不明显可置4冰箱24 h48 h再观察

5.5  可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等对木糖阴性鼠李糖阳性的纯培养物进行鉴定

5.6  小鼠毒力试验可选项目

将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中于36 1 培养24 h4 000 r/min离心5 min弃上清?#28023;?#29992;无菌生理盐水制备成浓度为1010 CFU/mL的菌悬?#28023;?#21462;此菌悬液3只5只小鼠进行腹腔注射每只0.5 mL同时观察小鼠死亡情况接种致病株的小鼠于2 d5 d内死亡试验设单增李斯特氏菌致病株和灭菌生理盐水对照单核细胞增生李斯特氏菌伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性

5.7  结果与报告

综合以上生化试验和溶血试验的结果,报告25 gmL样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌

 

 

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