微生物技术资料
文章检索
  首页 > 微生物知识->微生物基本知识->单核细胞增生李斯特氏菌检验(征求意见稿)二

单核细胞增生李斯特氏菌检验(征求意见稿)二


录入时间:2016-3-30 15:49:08 来源青岛海博生物

  单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法

6.  检验程序

7  操作步骤

7.1样品稀释

7.1.1 以无菌操作称取样品25gmL放入盛有225 mL 缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌均质均质杯连续均质1 min2 min以8000 r/min10000 r/min均质1 min2 min液体样品振荡混匀制成1:10的样品匀液

7.1.2 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液 1 mL沿管壁缓慢注于盛有9 mL缓冲蛋白胨水或无添加剂的LB肉汤的无菌试管中注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面振摇试管或换用 1 1 mL 无菌吸管反复?#33633;?#20351;其混合均匀制成1:100 的样品匀液

7.1.3 7.1.2 操作程序制备 10 倍系列稀释样品匀液每递增稀释一次换用 1 1 mL 无菌吸管或吸头

7.2样品接种

根据对样品污染状况的估计选择2个3个?#23460;?/span>连续稀释度的样品匀?#28023;?#28082;体样品可包括原?#28023;?#27599;个稀释度样品匀液分别吸取1 mL0.3 mL0.3 mL0.4 mL接种量分别加入3块李斯特氏菌显色或ALOA平板中用无菌L 棒涂布整个平板注意不要触及平板边缘使用前如琼脂平板表面有水珠可放在25 50 的培养箱里干燥直到平板表面的水珠消失

7.3 培养

7.3.1 在通常情况下涂布后将平板静置10 min如样液不易吸收可将平板放在培养箱36 1 培养1 h等样品匀?#20309;?#25910;后翻转平皿倒置于培养箱36 1 培养24h48h

7.4 典型菌落计数和确认

7.4.1单核细胞增生李斯特氏菌ALOA平板上为蓝绿色菌落,周围有不透明晕圈其他李斯特氏菌显色平板菌落特征以产品说明为准

7.4.2选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在15 CFU150 CFU之间的平板计数典型菌落数如果

a只有一个稀释度的平板菌落数在15CFU150CFU之间且有典型菌落计数该稀释度平板上的典型菌落

b所有稀释度的平板菌落数均小于15 CFU且有典型菌落应计数最低稀释度平板上的典型菌落

c某一稀释度的平板菌落数大于150 CFU 且有典型菌落但下一稀释度平板上没有典型菌落应计数该稀释度平板上的典型菌落

d所有稀释度的平板菌落数大于150 CFU 且有典型菌落应计数最高稀释度平板上的典型菌落

e所有稀释度的平板菌落数均不在15 CFU150 CFU 之间且有典型菌落其中一部?#20013;?#20110;15 CFU 或大于150CFU 时应计数最接近15CFU 或150 CFU的稀释度平板上的典型菌落

以上按公式1计算

f2 个连续稀释度的平板菌落数均在15CFU150 CFU 之间按公式2计算

7.4.3 从典型菌落中任选5 个菌落小于5 个全选分别按5.35.4或5.5进行鉴定和确认试验 

8.结果计数

公式1

 

式中

T样品中单核细胞增生李斯特氏菌落数

A某一稀释度典型菌落的总数

B某一稀释度?#20998;?#20026;单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数

C某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌?#20998;?/span>试验的菌落数

d稀释因子

公式2

 

式中

T 样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数

A1第一稀释度低稀释倍数典型菌落的总数

A2第二稀释度高稀释倍数典型菌落的总数

B1第一稀释度低稀释倍数?#20998;?#20026;单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数

B2第二稀释度高稀释倍数?#20998;?#20026;单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数

C1第一稀释度低稀释倍数用于单核细胞增生李斯特氏菌?#20998;?/span>试验的菌落数

C2第二稀释度高稀释倍数用于单核细胞增生李斯特氏菌?#20998;?/span>试验的菌落数

1.1计算系数

d 稀释因子第一稀释度

9.结果报告

报告每gmL样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数以CFU/gmL表示如T值为0则以小于1乘以最低稀释倍数报告

 

 

 单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法

10 检验程序

11操作步骤

11.1 样品的稀释

7.1进行

11.2接种和培养

11.2.1根据对样品污染状况的估计3个?#23460;?#36830;续稀释度的样品匀?#28023;?#28082;体样品可包括原?#28023;?/span>接种于10 mLLB1肉汤每一稀释度接种3管每管接种1 mL如果接种量需要超过1 mL则用双料LB1增菌液30 1 培养24 h2 h每管各移取0.1 mL转种于10 mL LB2增菌液内30 1 培养242 h

11.2.2 用接种?#21453;?#21508;管中移取1环分别接种李斯特氏菌显色或ALOA平板36 1 培养24 h48 h

11.3?#20998;?/span>试验

自每块平板上挑取5个典型菌落5个以下全选按照5.35.4或5.5进行鉴定

12  结果与报告

根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数查MPN检索表见附录B报告每gmL样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数以MPN/gmL表示

附录A

规范性附录

培养基和试剂

A.1  含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)

A.1.1  成分

      ?#20837;?/span>                                                17.0 g

      多价胨                                              3.0 g

      酵母膏                                              6.0 g

      氯化钠                                              5.0 g

      磷酸氢二钾                                          2.5 g

      葡萄糖                                              2.5 g

      蒸馏水                                              1 000 mL

      pH 7.27.4

A.1.2  制法

将上述各成分加热搅拌溶解调节pH分装121 高压灭菌15 min备用

A.2  0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)

A.2.1  成分

      ?#20837;?/span>                                               17.0 g

      多价胨                                             3.0 g

      酵母膏                                             6.0 g

      氯化钠                                             5.0 g

      磷酸氢二钾                                         2.5 g   

      葡萄糖                                             2.5 g

      琼脂                                               15.0 g

      蒸馏水                                             1 000 mL

pH 7.27.4

A.2.2  制法

    将上述各成分加热搅拌溶解调节pH分装121 高压灭菌15 min备用

A.3  李氏增菌肉汤(LB1LB2)

A.3.1  成分

      ?#20837;?/span>                                               5.0 g  

      多价胨                                             5.0 g

      酵母膏                                             5.0 g

      氯化钠                                             20.0 g

      磷酸二氢钾                                         1.4 g

      磷酸氢二钠                                         12.0 g

      七叶苷                                             1.0 g

      蒸馏水                                             1 000 mL

pH 7.27.4

A.3.2  制法

    将上述成分加热溶解调节pH分装121 高压灭菌15 min备用

A.3.2.1  李氏 (LB1)225 mL中加入

      1 % 萘啶酮酸 (0.05 mol/L氢氧化钠溶液配制)      0.5 mL

      1 % 啶黄 (用无菌蒸馏水配制)                    0.3 mL

A.3.2.2  李氏 (LB2)200 mL中加入

      1 % 萘啶酮酸                                     0.4 mL

      1 %啶黄                                        0.5 mL

A.4  PALCAM琼脂

A.4.1  成分

      酵母膏                                          8.0 g

      葡萄糖                                          0.5 g

      七叶甙                                          0.8 g

      柠檬酸铁铵                                      0.5 g

      甘露醇                                          10.0 g

      酚红                                            0.1 g

      氯化锂                                          15.0 g

?#19994;?#30333;胰酶消化物                                10.0 g

心胰酶消化物                                    3.0 g

玉米淀粉                                        1.0 g

      肉?#35813;?#28040;化物                                    5.0 g

氯化钠                                          5.0 g

琼脂                                            15.0 g

      蒸馏水                                          1 000 mL

pH 7.27.4

A.4.2  制法                         

    将上述成分加热溶解调节pH分装121 高压灭菌15 min备用

A.4.2.1  PALCAM选择性添加剂

      多粘菌素B                                      5.0 mg

      盐酸吖啶黄                                      2.5 mg

      头孢他啶                                        10.0 mg

      无菌蒸馏水                                      500 mL

A.4.2.2  制法

    PALCAM基础培养基溶化后冷?#21561;?/span>50 加入2 ml PALCAM选择性添加剂混?#32676;?#20542;倒在无菌的平皿中备用

A.5  ALOAAgar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA)琼脂

A.5.1 基础培养基

A.5.1.1  成分

动物组织的酶消化物                              18 g

?#19994;?#30333;胰酶消化物                                6 g

酵母提取物                                      10 g

丙酮酸钠                                        2 g

葡萄糖                                          2 g

?#35270;?#30967;酸镁                                      1 g

无水硫酸镁                                      0.5 g

氯化钠                                             5 g

氯化锂                                             10 g

无水磷酸氢钠                                       2.5 g

5 -- 4 --3吲哚--D吡喃葡萄糖苷                0.05 g

琼脂                                               12 g18 g(a)

蒸馏水                                             930 ml b

a 按琼脂强度确定

b 如果用两性霉素B925ml蒸馏水见A.5.5.2).

A.5.1.2  制法

上述成分进行加热溶解调pH7.2 0.2121C 高压灭菌15min

A.5.2 萘啶酮酸溶液

萘啶酮酸钠盐                                             0.02 g

0.05mol/l的氢氧化钠                                       5 ml

溶解萘啶酮酸钠于5ml氢氧化钠溶液中通过0.45m膜过滤4C保存备用

A.5.3 头孢他啶溶液

头孢他啶                                                0.02 g

无菌蒸馏水                                              5 ml

溶解头孢他啶于5ml无菌蒸馏水中通过0.45m膜过滤4C保存备用

A.5.4 多粘菌素B

多粘菌素B硫酸盐                                           76700 IU

无菌蒸馏水                                                 5 ml

溶解多粘菌素B5ml无菌蒸馏水中通过0.45m膜过滤4C保存备用

A.5.5 抗生素添加剂

A.5.5.1 放线菌酮溶液

放线菌酮                                                  0.05 g

乙醇                                                      2.5 ml

无菌蒸馏水                                                2.5 ml

溶解放线菌酮于2.5ml乙醇溶液中然后加入2.5ml无菌蒸馏水混?#21462;?#36890;过0.45m膜过滤4C保存备用

A.5.5.2  两性霉素B溶?#28023;?/span>可以替代放线菌酮溶?#28023;?/span>

两性霉素B                                                   0.01 g

1 mol/l 盐酸HCl (1 mol/l)                                   2.5 ml

二甲基甲酰胺(DMF)                                         7.5 ml

溶解两性霉素在盐酸/二甲基甲酰胺溶液通过0.45m膜过滤4C保存备用

注意---盐酸/二甲基甲酰胺溶液有毒小心使用

A.5.6  补充剂

溶解2g L--?#23383;?#37232;肌醇50 ml蒸馏水中搅拌30min制成均匀悬浮液121C 高压灭菌15min冷却至48C50C4C保存备用

A.5.7  完全培养基

A.5.7. 1成分

基础培养基                                                 930 ml(a)

萘啶酮酸钠溶液                                             5 ml

头孢他啶溶液                                               5 ml

多粘菌素B溶液                                             5 ml

放线菌酮溶液                                               5 ml

或两性霉素B溶液                                           10 ml

补充剂                                                    50 ml

a 如果使用两性霉素B溶液就需要925ml

A.5.7.2 制法

将基础培养基完全溶解冷?#21561;?/span>50 加入上述各种溶液混?#32676;?#20542;倒在无菌的平皿中备用完全培养基的pH值应为7.2 0.2

A.6  革兰氏染色液

A 6.1  结晶紫染色液

A.6.1.1  成分

结晶紫

1.0 g

95乙醇

20.0 mL

1草酸铵水溶液

80.0 mL

A 6.1.2  制法

将结晶紫完全溶解于乙醇中然后与草酸铵溶液混合

A 6.2  革兰氏碘液

A.6.2.1  成分

1.0 g

碘化钾

2.0 g

蒸馏水

300 mL

A.6.2.2  制法

将碘与碘化钾先进行混合加入蒸馏水少许充分振摇待完全溶解后再加蒸馏水至300 mL

A.6.3  沙?#32856;?#26579;液

A.6.3.1  成分

沙黄

0.25 g

95乙醇

10.0 mL

蒸馏水

90.0 mL

A.6.3.2  制法

将沙黄溶解于乙醇中然后用蒸馏水稀释

A.6.4  染色法

A.6.4.1  涂片用火焰固定后滴加结晶紫染?#28023;?#20316;用1min, 水?#30784;?/span>

A.6.4.2  滴加革兰氏碘?#28023;?#20316;用1 min水?#30784;?/span>

A.6.4.3  滴加95乙醇脱色约15 s30 s直至染色液被?#21561;?#19981;要过分脱色水?#30784;?/span>

A.6.4.4  滴加复染?#28023;?#22797;染1 min水?#30784;?#24453;干镜检

A.7  SIM 动力培养基 

A 7.1  成分

      ?#20837;?/span>                                                  20.0 g

      多价胨                                                6.0 g

      硫酸铁铵                                              0.2 g

      硫代硫酸钠                                            0.2 g

      琼脂                                                  3.5 g

      蒸馏水                                                1 000 mL

      pH 7.2

A.7.2  制法

将上述各成分加热混匀调节pH分装小试管121 高压灭菌15 min备用

A.7.3  试验方法

    挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM培养基中于30 培养24 h48 h观察结果

A.8  缓冲葡萄糖蛋白胨水(MRVP试验用)

A.8.1  成分

     多胨                                                 7.0 g

     葡萄糖                                               5.0 g

磷酸氢二钾                                           5.0 g

     蒸馏水                                               1 000 mL

A.1.1.1      pH 7.0成分

A.8.2  制法

    溶化后调节pH分装试管每管1 mL121 高压灭菌15 min备用

A.8.3  甲基红MR试验

A.8.3.1  甲基红试剂

A.8.3.1.1  成分

甲基红

10 mg

95 %乙醇

30 mL

蒸馏水

20 mL

A.8.3.1.2  制法

10 mg甲基红溶于30 mL 95 %乙醇中然后加入20 mL蒸馏水

A.8.3.1.3  试验方法

取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白冻水中36 1 培养2 d5 d滴加甲基红试剂一滴立即观察结果鲜红色为阳性黄色为阴性 

A.8.4  V-P试验

A.8.4.1  6 % -萘酚-乙醇溶液

成分及制法取-萘酚6.0 g加无水乙醇溶解定容至100 mL

A.8.4.2  40 %氢氧化钾溶液

成分及制法取氢氧化钾40 g加蒸馏水溶解定容至100 mL

A.8.4.3  试验方法

取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白冻水中36 1 培养2 d4 d加入6% -萘酚-乙醇溶液0.5 mL40 %氢氧化钾溶液0.2 mL充分振摇试管观察结果阳性反应立刻或于数?#31181;?#20869;出现红色如为阴性应放在36 1 继续培养1 h再进行观察

A.9  血琼脂

A.9.1  成分

蛋白胨                                               1.0 g
牛肉膏                                               0.3 g
氯化钠                                               0.5 g
琼脂                                                 1.5 g
蒸馏水                                               100 mL

    脱纤维羊血                                           5 mL8 mL

A 9.2  制法 

    除新?#37322;?#32420;维羊血外加热溶化上述各组分121 高压灭菌15 min冷到50 棬以无菌操作加入新?#37322;?#32420;维羊血摇匀倾注平板

A.10  糖发酵管

A.10.1  成分

    牛肉膏                                               5.0 g

    蛋白胨                                               10.0 g

    氯化钠                                               3.0 g

    磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)                            2.0 g

    0.2%溴麝香草酚蓝溶液                                 12.0 mL

    蒸馏水                                               1 000 mL

A.10.2  制法

A.10.2.1  葡萄糖发酵管按上述成分配好后按0.5 %比例加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内调节pH7.4115 高压灭菌15 min备用

A.10.2.2  其他各种糖发酵管可按上述成分配好后分装每瓶100 mL115 高压灭菌15 min另将各种糖类分别配好10%溶?#28023;?#21516;时高压灭菌将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内以无菌操作分装小试管

A.10.3  试验方法

    取适量纯培养物接种于糖发酵管36 1 培养24 h48 h观察结果蓝色为阴性黄色为阳性

A.11  过氧化氢酶试验

A.11.1  试剂

    3%过氧化氢溶?#28023;?#20020;用时配制

A.11.2  试验方法

    用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落, 置于洁净试管内,滴加3%过氧化氢溶液2 mL观察结果

A.11.3  结果

    于半?#31181;?#20869;发生气泡者为阳性不发生气泡者为阴性

A.12. 缓冲蛋白胨水BPW

A.12.1成分

蛋白胨                                             10.0g

氯化钠                                             5.0 g

磷酸氢二钠Na2HPO4•12H2O                         9.0 g

磷酸二氢钾                                         1.5 g

蒸馏水                                             1 000 mL

pH 7.2

A.12.2. 制法

加热搅拌至溶解,调节pH121 高压灭菌15 min


附录B

规范性附录

单核细胞增生李斯特氏菌最可能数MPN检索表

B.1 g(mL)检样中单核细胞增生李斯特氏菌最可能数MPN

 

上一篇单核细胞增生李斯特氏菌检验(征求意见稿)一

下一篇乳酸菌检验征求意见稿

相关文章:
单核细胞增生李斯特氏菌检验(征求意见稿)一 单核李斯特氏菌的典型特征
单核细胞增生李斯特菌概述 单核增生李斯特氏菌生物学特性
单核李斯特氏菌的典型特征 单核细胞增生李斯特菌检验特征
单核增生李斯特氏菌生物学特性 单核细胞增生李斯特氏菌鉴定
单核李斯特氏菌的典型特征 单核细胞增生李斯特菌的增菌检测方法
首页 | 关于我们 |网上商城| 加入收藏 | 在线客服 | 网?#38236;?#22270;| 联系我们
地址青岛市李沧区龙水路318号D座
电话400-0532-596 0532-66087773
6608776281935169

传真0532-81935080 66087775

?#27663;䣺[email protected]

QQ:4000532596

?#31471;?#19982;建议
电话13105190021 13006536294
?#27663;䣺[email protected]
©2001- 版权所有 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司 鲁ICP备05018323号
Ӱ߾糡1
Ϲؿ ٷͧͼ ݸĦ ʱʱ β֪β 28pcԤ ݲʿʮʮһѡ ӱʱʱֱֳ ţţѹǮ ʱʱɱ