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乳酸菌检验征求意见稿


录入时间:2016-4-1 15:25:31 来源青岛海博生物

1  范围

本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌lactic acid bacteria的检验方法

本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验

2  规范性引用文件

本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅所注日期的版本适用于本标准凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本标准

3  术语和定义

3.1  乳酸菌 lactic acid bacteria

    一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属Lactobacillus双歧杆菌属Bifidobacterium和链球菌属Streptococcus

4  设备和材料

除微生物实验?#39029;?#35268;灭菌及培养设备外其他设备和材料如下

4.1  恒温培养箱36 1

4.2  冰箱2 5

4.3  均质器及无菌均质袋均质杯或灭菌乳钵

4.4  天平感量0.1 g

4.5  无菌试管18 mm180 mm15 mm100 mm

4.6  无菌吸管1 mL0.01 mL刻度10 mL0.1 mL刻度或微量移液器及吸头

4.7  无菌锥形瓶500 mL250 mL

5  培养基和试剂

5.1  MRSMan Rogosa Sharpe培养基及莫匹罗星锂盐Li-Mupirocin改良MRS培养基见附录AA.1

5.2  MC培养基Modified Chalmers 培养基见附录AA.2

5.3  0.5%蔗糖发酵管:见附录AA.3

5.4  0.5%纤维二糖发酵管:见附录AA.3

5.5  0.5%麦芽糖发酵管:见附录AA.3

5.6  0.5%甘露醇发酵管:见附录AA.3

5.7  0.5%水杨苷发酵管:见附录AA.3

5.8  0.5%山梨醇发酵管:见附录AA.3

5.9  0.5%乳糖发酵管:见附录AA.3

5.10 七叶苷发酵管:见附录AA.4

5.11 革兰氏染色液见附录AA.5

5.12 莫匹罗星锂盐Li-Mupirocin化学纯

5.13 半胱氨酸盐酸盐Cysteine Hydrochloride纯度99%

6  检验程序

乳酸菌检验程序见图1

 

7  操作步骤

7.1样品制备

7.1.1  样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序

7.1.2  冷冻样品?#19978;?#20351;其在2 5 条件下解?#24120;?#26102;间不超过18 h也可在温度不超过45 的条件解?#24120;?#26102;间不超过15 min

7.1.3  固体和半固体食品以无菌操作称取25 g样品置于装有225 mL生理盐水的无菌均质杯内于8000 r/min10000 r/min均质1 min2 min制成1:10样品匀?#28023;?#25110;置于225 mL生理盐水的无菌均质袋中用拍击式均质器拍打1 min2 min制成1:10的样品匀液

7.1.4  液体样品液体样品应先将其充分摇?#32676;?#20197;无菌吸管吸取样品25 mL放入装有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶瓶内预?#27308;实?#25968;量的无菌玻璃珠中充分振摇制成1:10的样品匀液

7.2  步骤

7.2.1  1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL沿管壁缓慢注于装有9 mL生理盐水的无菌试管中注意吸管尖端不要触及稀释?#28023;?#25391;摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀制成1:100的样品匀液

7.2.2  另取1 mL无菌吸管或微量移液器吸头按上述操作顺序做10倍递增样品匀?#28023;?#27599;递增稀释一次即换用11 mL灭菌吸管或吸头

7.2.3  乳酸菌计数

7.2.3.1  乳酸菌总数

根据待检样品活菌总数的估计选择23个连续的?#23460;?#31232;释度每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内每个稀释度做两个平皿稀释液移入平皿后将冷却至50MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL转动平皿使混合均?#21462;?/span>361厌氧培养48 h2 h培养后计数从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成

7.2.3.2  双歧杆菌计数

    根据?#28304;?#26816;样品双歧杆菌含量的估计选择23个连续的?#23460;?#31232;释度每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内每个稀释度做两个平皿稀释液移入平皿后将冷却至50的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基倾注入平皿约15mL转动平皿使混合均361厌氧培养48 h2 h培养后计数平板上的所有菌落数从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成

7.2.3.3  嗜热链球菌计数

根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计选择23个连续的?#23460;?#31232;释度每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内每个稀释度做两个平皿稀释液移入平皿后将冷却至50MC培养基倾注入平皿约15mL转动平皿使混合均?#21462;?/span>361需氧培养48 h2 h培养后计数嗜热链球菌MC琼脂平板上的菌落特征为菌落中等偏小边缘整齐光滑的红色菌落?#26412;?span>2 mm1 mm 菌落背面为粉红色从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成

7.2.3.4  乳杆菌计数

    7.2.3.1 项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2 项双歧杆菌与7.2.3.3 嗜热链球菌计数结果之?#22270;吹?/span>乳杆菌计数

7.3  菌落计数

可用肉眼观察必要时用放大镜或菌落计数器记录稀释倍数和相应的菌落数量菌落计数以菌落形成单位colony-forming unitsCFU表示

7.3.1  选取菌落数在30 CFU300 CFU之间无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数低于30 CFU的平板记录具体菌落数大于300 CFU的可记录为多不可计每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数

7.3.2  其中一个平板有较大片状菌落生长时则不宜采用而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数若片状菌落不到平板的一半而其余一半中菌落?#26893;?#21448;很均匀即可计算半个平板后乘以2代表一个平板菌落数

7.3.3  当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时则将?#21051;?#21333;链作为一个菌落计数

7.4  结果的表述

7.4.1  若只有一个稀释度平板上的菌落数在?#23460;?#35745;数范围内计算两个平板菌落数的平均值再将平均值乘以相应稀释倍数作为每gmL中菌落总数结果

7.4.2  若有两个连续稀释度的平板菌落数在?#23460;?#35745;数范围内时按公式1计算

 

 

式中

N样品中菌落数

C平板含?#23460;?#33539;围菌落数的平板菌落数之和

n1第一稀释度低稀释倍数平板个数

n2第二稀释度高稀释倍数平板个数

d稀释因子第一稀释度

 

7.4.3  若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU则对稀释度最高的平板进行计数其他平板可记录为多不可计结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算

7.4.4  若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算

7.4.5  若所有稀释度包括液体样品原?#28023;?#24179;板均无菌落生长则以小于1乘以最低稀释倍数计算

7.4.6  若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU300 CFU之间其中一部?#20013;?#20110;30 CFU或大于300 CFU时则以最接近30 CFU300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算

7.5  菌落数的报告

7.5.1  菌落数小于100 CFU时按四舍五入原则修约以整数报告

7.5.2  菌落数大于或等于100 CFU时第3位数?#26893;?#29992;四舍五入原则修约后取前2位数字后面用0代替位数也可用10的指数?#38382;?#26469;表示按四舍五入原则修约后采用两位?#34892;?#25968;字

7.5.3  称重取样以CFU/g为单位报告体积取样以CFU/mL为单位报告

8  结果与报告

根据菌落计数结果出具报告报告单位以CFU/gmL表示

9  乳酸菌的鉴定可选做

9.1  纯培养

挑取3个或以上单个菌落嗜热链球菌接种于MC琼脂平板乳杆菌属接种于MRS琼脂平板置36 1 厌氧培养48 h

 

9.2  鉴定

9.2.1  双歧杆菌的鉴定按GB 4789.34的规定操作

9.2.2  涂片镜检乳杆菌属菌体形态多样?#39135;?#26438;状弯曲杆状或?#35848;?#29366;无芽胞革兰氏染色阳性嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状?#26412;?#20026;0.5 m2.0 m成对或成链排列无芽胞革兰氏染色阳性

9.2.3  乳酸菌菌种主要生化反应见表1和表2

 

 

  A  

培养基及试剂

A.1  MRS培养基

A.1.1  成分

蛋白胨

10.0 g

牛肉粉

5.0 g

酵母粉

4.0 g

葡萄糖

20.0 g

吐温80

1.0 mL

K2HPO47H2O

2.0 g

醋酸钠3H2O

5.0 g

柠檬酸三铵

2.0 g

MgSO47H2O

0.2 g

MnSO44H2O

0.05 g

琼脂粉

pH 6.2

15.0 g

A.1.2  制法

将上述成分加入到1 000 mL蒸馏水中加热溶解调节pH分装后121 高压灭菌15 min20 min

A.1.3  莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS培养基

A.1.3.1  莫匹罗星锂盐储备液制备称取50mg莫匹罗星锂盐加入到50 mL蒸馏水中用0.22 mm微孔?#22235;?#36807;滤除菌

A.1.3.2  半胱氨酸盐酸盐储备液制备称取250mg莫匹罗星锂盐加入到50 mL蒸馏水中用0.22 mm微孔?#22235;?#36807;滤除菌

A.1.3.2  制法

A.1.1 成分加入到950 mL蒸馏水中加热溶解调节pH分装后121 高压灭菌15 min20 min临用时加热熔化琼脂在水浴中冷至48 用带有0.22 mm微孔?#22235;?#30340;注射器将莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50 mg/mL半胱氨酸盐酸盐的浓度为500 mg/mL

A.2  MC培养基

A.2.1  成分

大豆蛋白胨           

5.0 g

牛肉粉

3.0 g

酵母粉

3.0 g

葡萄糖

20.0 g

乳糖                         

20.0 g

碳酸钙

10.0 g

琼脂

15.0 g

蒸馏水

1 000 mL

1中性红溶液

pH6.0

5.0 mL

 

A.2.2  制法

将前面7种成分加入蒸馏水中加热溶解调节pH加入中性红溶液分装后121 高压灭菌15 min20 min

A.3  乳酸杆菌糖发酵管

A.3.1  基础成分

牛肉膏

5.0 g

蛋白胨

5.0 g

酵母浸膏

5.0 g

吐温80

0.5 mL

琼脂

1.5 g

1.6%溴甲酚紫酒精溶液

1.4 mL

蒸馏水

1 000 mL

A.3.2  制法

0.5%加入所需糖类并分装小试管,121 高压灭菌15 min20 min

A.4七叶苷培养基

A.4.1 成分

 

蛋白胨

5.0 g

磷酸氢二钾

1.0 g

七叶苷

3.0 g

枸橼酸铁

0.5 g

1.6%溴甲酚紫酒精溶液

1.4 mL

蒸馏水

100 mL

A.4.2  制法

将上述成分加入蒸馏水中加热溶解121 高压灭菌15 min20 min

A.5革兰氏染色液

A.5.1  结晶紫染色液

A.5.1.1  成分

结晶紫

1.0 g

95乙醇

20 mL

1草酸铵水溶液

80 mL

A.5.1.2  制法

将结晶紫完全溶解于乙醇中然后与草酸铵溶液混合

A.5.2  革兰?#31995;?#28082;

A.5.2.1  成分

1.0 g

碘化钾

2.0 g

蒸馏水

300 mL

A.5.2.2  制法

将碘与碘化钾先进行混合加入蒸馏水少许充分振摇待完全溶解后再加蒸馏水至300 mL

A.5.3  沙?#32856;?#26579;液

A.5.3.1  成分

沙黄

0.25 g

95乙醇

10 mL

蒸馏水

90 mL

A.5.3.2  制法

将沙黄溶解于乙醇中然后用蒸馏水稀释

A.5.4  染色法

A.5.4.1 将涂片在酒精灯火焰上固定滴加结晶紫染色?#28023;?#26579;1 min水?#30784;?/span>

A.5.4.2 滴加革兰?#31995;海?#20316;用1 min水?#30784;?/span>

A.5.4.3 滴加95乙醇脱色约15 s30 s直至染色液被?#21561;?#19981;要过分脱色水?#30784;?/span>

A.5.4.4 滴加复染?#28023;?#22797;染1 min水?#30784;?#24453;干镜检

 

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